吗啡预处理对缺血再灌注损伤后大鼠心脏中Caspase-3表达及细胞凋亡的影响

朱 瑞，金世云，郭成晓，张 野

体外循环下行心脏手术是多种心脏疾病如心瓣膜病、冠心病及先天性心脏病等主要治疗手段。然而实施体外循环后，心脏常经历全心缺血及再灌注过程，不可避免会发生心肌缺血再灌注损伤(ischemia-reperfusion injury, IRI)。吗啡作为临床经典的阿片类镇痛药，在基础研究及临床实践中均表明可减轻心肌IRI，虽然目前对吗啡心肌保护作用的研究较为广泛，但其确切机制仍未能完全阐明。细胞凋亡是IRI过程中主要机制之一，Caspase-3作为细胞凋亡中关键调控因子，其是否参与吗啡降低心肌细胞凋亡水平，减轻IRI目前尚不明确。该研究通过制备大鼠全心缺血再灌注损伤模型，观察吗啡预处理(morphine preconditioning, MP)对全心缺血再灌注后心肌中Caspase-3表达及细胞凋亡的影响，以进一步明确MP心肌保护作用的机制。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器

盐酸吗啡注射液(1 ml：10 mg，批号：190104-2，东北制药集团沈阳第一制药有限公司)；氯化三苯基四氮唑(triphenyltetrazolium chloride，TTC)(批号：129K1867V，美国Sigma公司)；乳酸脱氢酶(lactic dehydrogenase，LDH)试剂盒(南京建成生物工程研究所)；兔抗Caspase-3单克隆抗体(美国Cell Signaling公司)；鼠抗β-actin单克隆抗体(美国Santa Cruz公司)；Langendorff离体心脏灌注系统(安徽淮北正华有限责任公司)；Power Lab数据采集装置(澳大利亚AD公司)。

1.2 实验动物及全心缺血再灌注损伤模型制备

健康雄性成年SD大鼠，体质量为220～260 g，由安徽医科大学实验动物中心提供，许可证号：SCXK(皖)2017-001。参照参考文献制备全心离体缺血再灌注损伤模型，SD大鼠断头处死，剔除非心脏组织，迅速取出心脏置于4 ℃ K-H液(mmol/L：118.5 NaCl、4.7 KCl、1.2 MgSO、25.0 NaHCO、1.2 KHPO、11.0葡萄糖、2.5 CaCl)中，立刻悬挂于Langendorff灌注装置上，采用9.8 kPa恒压逆行灌注K-H液。使用95% O和5% CO混合气预充K-H液，并维持pH值7.35～7.45，温度37 ℃。于心脏左心耳剪个小口，将一自制乳胶水囊由该小口经二尖瓣置入左心室，连接Power Lab压力传感器，调节水囊大小及位置，保持左室舒张末压在0～1.33 kPa之间。操作完成，待心脏稳定15 min后，心脏有心律失常或左室发展压<9.31 kPa的弃之不用。

1.3 实验分组与处理

51只SD大鼠使用随机数字表法分为3组(

n

=17)：对照组(Sham组)、全心缺血再灌注组(IR组)、MP组(1 μmol/L，MP组)。于大鼠心脏稳定15 min后通过夹闭灌注导管全心缺血30 min，再恢复灌注10、60、120 min，制备全心缺血再灌注损伤模型。Sham组心脏持续灌K-H液至实验结束(195 min)。IR组于心脏灌注45 min K-H液后进行全心缺血再灌注。MP组于心脏稳定15 min后，灌注含1 μmol/L盐酸吗啡的K-H液和无吗啡的K-H液各5 min，进行3个周期后制备全心缺血再灌注损伤模型。

1.4 心肌梗死体积百分比测定

再灌注120 min后取下大鼠心脏(

n

=8)，将心脏置于-80 ℃冰箱充分冷冻后，沿心脏纵轴线切成2 mm的薄片5～6片，置于1% TTC溶液(pH 7.4)中，37 ℃水浴锅中孵育10 min，然后于10%福尔马林液固定过夜，白色为的梗死区(infarct size，IS)，砖红色为缺血危险区(area at risk, AAR)。采用Imaging J 1.51图像分析软件计算IS及AAR，并计算IS/AAR比值。

1.5 LDH活性测定

所有组离体心脏于稳定灌注15 min(基础值)、再灌注后10、60、120 min时收集冠状动脉流出液3～5 ml，采用化学比色法测定LDH活性。

1.6 Western blot测定Caspase-3蛋白表达

于再灌注10、60及120 min时取下大鼠心脏(

n

=9即每组每个时间点3只，同一大鼠心脏分别进行Western blot试验和TUNEL染色)。取组织标本剪碎，加入RIPA裂解液，冰上静止60 min，4 ℃ 高速离心机13 000 r/min离心15 min后取上清液，行BCA蛋白定量。按1∶4加入×5上样缓冲液于蛋白质样本中，水浴100 ℃变性10 min，使用蛋白预制胶进行SDS-PAGE电泳。110 V电泳60 min，然后200 mA电转移至 PVDF膜，封闭液(含5%脱脂牛奶的TBST溶液)室温孵育PVDF膜2 h，TBST溶液漂洗10 min×3次后，加入1∶1 000的Caspase-3兔一抗及β-actin小鼠一抗，4 ℃孵育过夜后TBST液漂洗10 min×3次，加入1∶10 000二抗室温孵育1 h，TBST液漂洗10 min×3次，采用ECL发光试剂盒，使用Tanon全自动凝胶成像系统扫描PVDF膜，采集图像。使用Image J 1.51图像分析软件分析Caspase-3与β-actin的蛋白灰度值，并以Sham组为参照计算各组蛋白相对比值。

1.7 TUNEL染色

于再灌注10、60、120 min时取下大鼠心脏(

n

=9)，将心肌组织蜡块固定切片(5 μm)，经脱蜡、水化后加入蛋白酶K工作液37 ℃处理20 min，漂洗3次后过氧化物酶封闭30 min，加入50 μl Tunel反应液于37 ℃暗湿盒反应1 h，漂洗3次加入POD转换液于37 ℃暗湿盒反应30 min，漂洗3次进行DAB显色，苏木精复染，碳酸锂蓝化，脱水透明，中性树胶封片，扫描仪扫描后进行观察心肌细胞凋亡情况。

2 结果

2.1 TTC染色显示

各组AAR体积差异均无统计学意义；与Sham组比较，IR组再灌注后IS/AAR比值显著升高(

P

<0.05)，与IR组比较，MP组可显著降低缺血再灌注后IS/AAR比值(

F

=136.44，

P

<0.05)。见图1。

图1 3组大鼠心肌梗死面积TTC染色结果

2.2 冠脉流出液中LDH活性检测显示

3组LDH基础值差异无统计学意义；与基础值比较，各组在再灌注后LDH活性均升高，IR及MP组在再灌注10 min时LDH水平达到最高，随着再灌注时间的延长LDH值逐渐降低；与Sham组比较，IR组在再灌注后各时间点LDH值均显著升高，差异有统计学意义(

F

=259.35，

P

<0.05)；与IR组比较，MP组再灌注10、60及120 min时冠脉流出液LDH活性均降低，差异有统计学意义(

F

=62.52，

P

<0.05)。见表1。

表1 3组大鼠再灌注后不同时点冠脉流出液LDH活性的比较

2.3 Western blot结果显示

Sham组各时点间Caspase-3蛋白表达差异无统计学意义；与Sham组比较，IR组在再灌注后各时点Caspase-3蛋白表达中均显著升高，差异有统计学意义(

F

=23.38，

P

<0.05)，其中再灌注后60 min时相对表达最高；与IR组比较，MP组可显著逆转各时点IR引起的凋亡蛋白Caspase-3的升高，差异有统计学意义(

F

=77.78，

P

<0.05)。见图2。

图2 3组大鼠心肌细胞Caspase-3蛋白表达的比较

2.4 TUNEL染色结果显示

Sham组心肌细胞凋亡比例均维持在较低水平，虽然随再灌注时间延长有增加的趋势，但各时点间差异无统计学意义；与Sham组比较，IR组心肌凋亡比例在再灌注检测的各时点中均显著升高(

F

=192.11，

P

<0.05)，其中再灌注120 min时心肌细胞凋亡比例最高；与IR组比较，MP组在再灌注后心肌凋亡也逐渐增加，但各时点心肌凋亡比例均较IR组降低，差异有统计学意义(

F

=84.32，

P

<0.05)。见图3。

图3 3组大鼠心肌细胞TUNEL染色结果 HE×400

3 讨论

参照参考文献介绍的方法，该研究采用Langendorff离体心脏灌注装置制备大鼠全心缺血再灌注模型模拟体外循环下心脏手术中心肌缺血再灌注过程。TTC染色及心肌酶学检测显示，IR组IS/AAR百分比及LDH水平显著增加，提示全心缺血再灌注损伤模型建立成功。该研究参照文献选择MP的浓度为1 μmol/L，MP组可显著逆转IR引起的IS/AAR百分比及再灌注5 min 时LDH水平的升高，这与该课题前期研究结果一致，提示1 μmol/L MP具有心肌保护作用。

细胞凋亡是缺血再灌注损伤过程中主要机制之一，Caspase-3作为细胞凋亡关键调控因子，抑制再灌注期间Caspase-3蛋白的表达可以显著减轻心肌缺血后再灌注损伤。吗啡作为临床中经典的强效阿片类镇痛药物，不仅可以减轻正常心肌的缺血后损伤，还可以对病理状态下的缺血后心肌发挥保护作用。该研究检测到MP可以显著逆转缺血后再灌注后心肌组织各时点的Caspase-3蛋白表达水平，同时降低再灌注后各时间点心肌细胞凋亡百分比。该课题前期研究显示MP减轻全心缺血后损伤与再灌注损伤补救激酶细胞外调节激酶(extracellular signal-regulated kinase, ERK)蛋白的表达升高密切相关，结合该实验后期将进一步探讨MP的心肌保护机制是否经阿片受体介导后调控ERK蛋白激酶，进一步抑制Caspase-3等凋亡蛋白的表达，降低再灌注后心肌细胞凋亡。Hausenloy et al研究提示再灌注损伤补救激酶ERK蛋白的表达水平在心肌再灌注后起始阶段升高，该研究表明LDH的水平在再灌注初始阶段最高，随着再灌注时间的延长逐渐降低，同时Caspase-3蛋白水平在心肌再灌注后60 min内逐渐达到高峰，与之不同的是心肌细胞凋亡率随着再灌注时间的延长逐渐升高，这提示心肌再灌注早期可能是MP发挥心肌保护作用的关键阶段。