皮质下缺血性血管病与对氧磷酶1基因多态性的相关性研究

高文平，宋莉莉，王 瑶，倪明珠，王兆平，王文静

皮质下缺血性血管病(subcortical ischemic vascular disease, SIVD)是一种以弥漫性脑白质病变(white matter lesions, WML)和多发腔隙性梗死(lacunar infarction, LI)为特征的脑小血管病，是血管性痴呆(vascular dementia, VaD)的主要亚型之一，虽然其发病率较高，但均质性较好，成为近年来学者们研究的热点。SIVD的确切发病机制尚不清楚，近年来的研究表明其与遗传因素、动脉粥样硬化、Aβ蛋白沉积、血脑屏障损害等有关。对氧磷酶1(paroxyphospase 1, PON1)是一种芳香酯酶，具有抗氧化及抗动脉粥样硬化的作用，其活性及表达主要受PON1基因Q192R和L55M位点基因多态性的影响。有研究表明，PON1活性降低可能与缺血性脑卒中、冠心病等动脉粥样硬化相关的疾病发生有关。因此，PON1基因多态性可能也与SIVD的发病相关，目前两者间的关系尚无定论。该研究拟通过临床资料的收集对比、影像上的差异以及基因检测的方法探索PON1基因多态性与SIVD疾病的相关性，为寻找防治SIVD的新靶点提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 病例资料

随机选取2019年11月—2020年6月在安徽医科大学附属省立医院神经内科就诊的SIVD患者65例。SIVD组纳入标准参照Erkinjuntti提出的诊断标准并加以修订：① 年龄50～85(66.28±8.80)岁；② 头颅磁共振(MRI)检查T2、Flair成像提示皮质下多发LI(LI≥5个)和(或)脑室旁及深部广泛WML(Fazekas分级≤2级)；③ 近6个月内无急性LI发生。SIVD组排除标准：① 有皮质梗死、脑肿瘤、脑外伤、颅脑手术、脑出血史；② 非血管性因素引起的脑白质病变：如代谢、多发性硬化、免疫、中毒等；③ 有风湿性疾病、感染性疾病、血液系统疾病、严重肝肾功能不全等；④ 近1月有手术史。对照组纳入标准：选取同时期年龄50～85(61.26±7.99)岁、一般临床资料相仿、头颅MRI正常的体检者35例作为对照组。所有研究对象及家属均知情同意并签署知情同意书。

1.2 方法

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临床资料的收集 一般资料包括年龄、性别、高血压、糖尿病、冠心病、心房颤动、肝肾疾病、吸烟饮酒史等。实验室检测包括血糖、血脂、同型半胱氨酸(homocysteine, Hcy)、肝肾功能等指标。

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影像学检查 采用3.0 T MRI机(德国西门子公司)扫描，根据头颅MRI T1、T2和Flair像，评估所有受试者的脑损伤程度。LI的数量：计皮质下直径3～15 mm、边界清晰的缺血灶数量。参照Fazekas分级方法将WML进行分级：0级(无白质病变)，1级(轻度，病变为斑点状)，2级(中度，病变开始融合)，3级(重度，病变融合为弥漫性病变)。SIVD组WML和LI常合并存在，无法绝对区分，可依据Fazekas分级及LI数量将所有SIVD组受试者分为WML组和LI组，并分别按照脑损伤程度不同等级进行以下分组：① WML组(以WML为主且LI数量≤5个)：轻度WML组(Fazekas分级为1级)、中度WML组(Fazekas分级为2级)、重度WML组(Fazekas分级为3级)；② LI组(以LI为主，可伴有脑白质损害)：轻度LI组(LI数量≤5个)、中度LI组(5个10个)。

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标本的采集和PON1基因型的检测 使用EDTA抗凝管采集受试者清晨空腹肘静脉血2 ml，于-80 ℃冰箱冻存。采用sanger测序法检测所有受试者的PON1基因Q192R及L55M两个位点的基因型。① 按照Ezup柱式血液基因组DNA抽提试剂盒(上海生工生物公司)说明书提取白细胞DNA；② 引物设计：使用Primer Premier 5软件设计引物，Q192R基因上游引物序列为5′-ATTTCAGAGAGTTCACATACTTGCC-3′，下游引物序列为5′-GAATAGACAGTGAGGAATGCCAG-3′，扩增片段308 bp；L55M基因上游引物序列为5′-TTATTTGAAAGTGGGCATGGG-3′，下游引物序列为5′-TCAAGTGAGGTGTGATAAAGAAATG-3′，扩增片段244 bp；③ PCR反应：PCR反应体系总体积为25 μl，模板DNA 2 μl，上下游引物各1 μl，dNTP(Mix)1 μl，10×Taq buffer(含MgCl)2.5 μl，Taq酶0.2 μl，加双蒸水至25 μl；PCR反应条件：95 ℃预变性5 min，94 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，循环38次，72 ℃修复延伸10 min；④ DNA测序及SNP分型：取5 μl PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定后，采用sanger测序法进行测序及SNP分型，由美国ABI 3037 XL全自动测序仪得出DNA测序峰图。

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吸烟和饮酒的定义 ① 吸烟定义：平均吸烟≥1支/d，持续时间>12个月，吸烟状况分为不吸烟、目前吸烟和已戒烟，已戒烟是指曾经吸烟但已停止吸烟至少12个月；② 饮酒定义：过去1个月饮酒次数≥1次/周，饮酒状况分为不饮酒、目前饮酒和已戒酒，已戒酒是指曾经饮酒但已停止饮酒至少6个月。

2 结果

2.1 SIVD组和对照组一般资料和脑损伤程度的比较

SIVD组和对照组性别、高血压、糖尿病、饮酒状况、血清三酰甘油(TG)、总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、极低密度脂蛋白胆固醇(VLDL-C)、同型半胱氨酸(Hcy)水平差异均无统计学意义。与对照组比较SIVD组的平均年龄增高(

P

<0.05)，SIVD组的高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)水平降低(

P

<0.05)，2组吸烟状况有统计学差异(

P

<0.05)。SIVD组的Fazekas分级及LI数量高于对照组(

P

<0.001)。见表1。

表1 SIVD组与对照组一般临床资料和脑损伤程度比较

2.2 SIVD组和对照组PON1基因Q192R、L55M位点测序结果、基因型分布和等位基因频率比较

SIVD组和对照组PON1基因Q192R、L55M位点的测序图分别如图1、2所示。SIVD组和对照组PON1基因Q192R、L55M基因型分布均符合Hardy-Weinberg平衡定律。SIVD组与对照组PON1基因Q192R和L55M基因型分布差异均有统计学意义(

P

<0.05)，SIVD组R等位基因频率和M等位基因频率高于对照组(

P

<0.05)。见表2。

表2 SIVD组与对照组PON1基因Q192R、L55M位点基因型分布和等位基因频率比较[%，n(%)]

图1 PON1基因Q192R位点测序图

2.3 WML组和LI组PON1基因Q192R、L55M基因型分布和等位基因频率比较

WML组和LI组PON1基因Q192R和L55M基因型分布和等位基因频率差异均无统计学意义。见表3。

表3 WML组与LI组PON1基因Q192R、L55M位点基因型分布和等位基因频率比较[%，n(%)]

2.4 WML组和LI组内不同等级脑损伤程度的

PON1基因Q192R、L55M基因型分布和等位基因频率比较

① WML组分为轻度WML组、中度WML组和重度WML组，3组间PON1基因Q192R、L55M位点基因型分布差异均无统计学意义，Q192R、L55M位点等位基因频率差异均有统计学意义(

P

<0.05)。重度WML组R等位基因频率分别高于中度WML组和轻度WML组(

P

<0.016 7)，中度WML组和重度WML组的M等位基因频率均高于轻度WML组(

P

<0.016 7)。② LI组分为轻度LI组、中度LI组和重度LI组，3组间PON1基因Q192R、L55M位点基因型分布差异均无统计学意义，Q192R、L55M位点等位基因频率差异均有统计学意义(

P

<0.05)。重度LI组R等位基因频率分别高于中度LI组和轻度LI组(

P

<0.016 7)，中度LI组和重度LI组的M等位基因频率均高于轻度LI组(

P

<0.016 7)。其余组间两两比较差异均无统计学意义。见表4、5。

图2 PON1基因L55M位点测序图

表4 WML组内PON1基因Q192R、L55M位点基因型分布和等位基因频率比较[%，n(%)]

表5 LI组内PON1基因Q192R、L55M位点基因型分布和等位基因频率比较[%，n(%)]

2.5 SIVD危险因素的多因素Logistic回归分析

将有无SIVD作为因变量，将年龄、吸烟、HDL水平、携带R等位基因、携带M等位基因作为自变量，进行Logistic回归分析。在回归方程中，将有SIVD赋值为1，无SIVD赋值为0；吸烟：不吸烟赋值为0，已戒烟赋值为1，目前吸烟赋值为2；携带R等位基因：QQ基因型赋值为0，QR基因型赋值为1，RR基因型赋值为2；携带M等位基因：LL基因型赋值为0，LM基因型赋值为1。年龄及HDL-C水平均以连续型变量直接纳入模型。结果显示：在控制各项因素后，年龄、吸烟、携带R等位基因、携带M等位基因均为SIVD患病的独立危险因素。见表6。

表6 SIVD影响因素多因素Logistic回归分析

2.6 PON1基因Q192R和L55M位点多态性的交互作用分析

通过条件Logistic回归，在调整年龄、吸烟及HDL-C水平等因素后，Q192R位点和L55M位点多态性对SIVD患病无统计学交互作用(

P

=0.908,

OR

=1.438, 95%

CI

=0.003～692.434)。

3 讨论

以WML和LI为特征的SIVD是老年人中较常见的脑小血管病，其起病较隐匿，早期认知功能可能正常，随着病情进展逐渐出现认知能力下降。其临床表现除认知障碍外，还包括步态异常、假性球麻痹、尿便障碍和锥体外系症状。因此，早期发现对于及时治疗和改善预后至关重要。

对氧磷酶(paraoxonase, PON)基因家族都与抗动脉粥样硬化相关，其中PON1的抗动脉粥样硬化活性最强，被学者们广泛研究。PON1是一种Ca依赖的酯酶，在血液中与高密度脂蛋白(HDL)紧密结合，可防止低密度脂蛋白(LDL)氧化，促进HDL的抗动脉粥样硬化，在调节胆固醇反向转运(reverse cholesterol transport, RCT)、抗氧化、抗凋亡、抗炎、血管舒张和抗血栓形成以及几种内皮细胞功能中也发挥作用，与冠心病、缺血性脑卒中等疾病密切关联。PON1基因位于人类第7号染色体长臂(7q21.3～q22.1)上。有研究表明，人血清中的PON1活性有40倍的差异，这可能是由PON1基因编码区的多态性共同决定的，其中Q192R和L55M位点的多态性表现发挥主要作用。

目前，PON1的基因多态性与SIVD的关系尚无定论。该研究结果显示，SIVD组PON1基因192位的R等位基因频率和55位的M等位基因频率均高于对照组，根据脑损伤程度不同等级进一步分组发现，WML组内和LI组内病变程度较高的组别其R和M等位基因频率更高，提示其R和M等位基因可能在SIVD的发病和脑损伤的过程中均有一定的促进作用。条件Logistic回归和多因素Logistic回归分析结果提示，携带其R和M等位基因均为SIVD患病的独立危险因素，且携带M等位基因对SIVD发病的影响可能更大。

因此，SIVD的发病可能与PON1基因Q192R和L55M位点的多态性表现相关。具体而言，其R和M等位基因影响SIVD的发生发展的机制可能如下：① PON1基因Q192R和L55M基因多态性可影响PON1的活性，携带R等位基因虽比携带Q等位基因的PON1活性更高，但携带R等位基因会抑制PON1对LDL免受氧化的保护，而携带M等位基因相比携带L等位基因的PON1活性较低，因此，携带R等位基因与携带M等位基因均可使PON1的抗动脉粥样硬化功能受限。② PON1水解脂质过氧化物，保护LDL免受氧化，降低循环和血管壁中氧化的LDL，减少泡沫细胞的形成和巨噬细胞的氧化应激以及刺激HDL介导的RCT，促进内皮功能正常化，从而抗动脉粥样硬化。③ PON1与HDL之间的联系不仅是简单的配体-载体关系，PON1也可以保护HDL免受氧化。血脂异常、氧化应激和炎症均可引起HDL的结构剧烈变化，从而减弱HDL抗动脉粥样硬化潜力。HDL结构的改变可影响PON1的活性，氧化的HDL增强PON1活性的能力也明显降低。④ PON1也是一种乳酸酶，能降解同型半胱氨酸硫代内酯(HycTL)。HycTL是一种Hcy代谢物，可通过N型半胱氨酸化机制修饰蛋白的赖氨酸残基，进而影响蛋白的结构和功能，导致氧化应激、内皮功能障碍、血栓形成、自身免疫反应、细胞死亡和动脉粥样硬化。PON1通过代谢HycTL，限制蛋白的N同型半胱氨酸化，从而延缓动脉粥样硬化的发展。

该研究对SIVD的影响因素进行了多因素Logistic回归分析，结果显示，吸烟与年龄增长也会增加SIVD的发病风险，这可能也与PON1的活性和表达降低有关。PON1的活性和表达也受年龄、炎症、饮食、药物、糖尿病、吸烟和生活方式的影响。有研究表明，吸烟者血清中PON1的活性和浓度低于非吸烟者，不过这种影响在戒烟后可消除，故而戒烟对于预防SIVD具有重要意义。同时，PON1活性也随着年龄的增长而降低，这也与老年群体中HDL对氧化的敏感性增加有关。另外，该研究中未检测到PON1基因55位MM基因型，可能与MM是一种较为罕见的基因型有关，这与国内外的研究结果一致。

综上所述，尽管该研究的样本量有限，未能对年龄、吸烟等因素进一步分层分析，但该研究的结果表明，SIVD的发病可能与PON1基因多态性有关，携带第192位R等位基因与第55位M等位基因可能对SIVD的发病有一定的促进作用，这些发现为寻找SIVD防治新的靶点具有重要意义。