益生菌对NICU早产儿的肠道菌群代谢功能及临床疾病的影响

宫 晨，杨琍琦，程 雁

人类肠道微生物群是目前存在的微生物群落中最复杂和最多样的，对健康起着重要作用。NICU病房中的早产儿常处于临床和生理上的限制中，包括各种留置管的使用、抗生素暴露以及延迟的肠内喂养等。这些因素导致了早产儿肠道菌群定植延迟和紊乱。而肠道菌群的失衡被认为与早产儿的许多疾病密切相关。因此，尽早干预肠道菌群非常必要。益生菌是目前最常见的干预措施，有助于早产儿尽早建立一个稳定的肠道菌群，并且可以降低早产儿发生相关疾病的风险。

虽然已有研究表明益生菌对早产儿肠道菌群的作用，但却缺乏功能和机制方面的分析。该研究旨在探讨益生菌对NICU早产儿肠道菌群代谢组学的影响，从代谢组数据中识别功能代谢变化，并同时对临床疾病的差异进行分析，以确定肠道菌群紊乱的NICU早产儿的临床特征。

1 材料与方法

1.1 病例资料

选取出生后立即入住该院NICU的胎龄28～37周早产儿40例。排除标准：喂养困难，先天性胃肠畸形，严重呼吸暂停等。该研究经安医大二附院伦理委员会批准(批准号：PJ 2016-05-01)，所有入选早产儿均经家长知情同意。

1.2 方法

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分组 所有入选早产儿随机分为益生菌组和对照组，每组20例。两组均予以原发病治疗及配方奶合理喂养，益生菌组早产儿开奶后加用双歧杆菌三联活菌散剂口服(上海上药信谊药厂有限公司；国药准字S10970104；每包含量2 g，含活菌数分别不低于2.0×10CFU)，0.5包/次，每天2次。

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样本收集 在出生后第10 d时收集两组早产儿的粪便样本。并立即存放至已消毒的冷冻试管中，置于液氮中转送-80 ℃冰箱中保存。

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临床指标收集 ① 两组早产儿在出生后第0天和10天进行血常规及血生化检测，并记录血红蛋白、血小板、总胆红素、直接胆红素等。② 记录两组早产儿恢复出生体质量的时间，发生腹泻、败血症(根据血培养结果确诊)、NEC(根据临床表现及影像学确诊)及喂养不耐受(胃潴留≥前次喂养量的50% ,每3 h进食1次；频繁呕吐>3次/d,或者腹胀；打乱肠内营养计划,包括减少、延迟或停止肠内营养)的例数。

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肠道菌群检测 将采取十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)的方法提取的样本基因组DNA作为模版，针对细菌16S rRNA的V4区选择相应的引物，进行PCR扩增。然后使用Thermofisher的IonS5TMXL平台进行高通量测序。测序的原始结果进行处理后得出有效数据，然后通过Uparse软件(Uparse v7.0.1001)进行序列分析，筛选每个OTU的代表性序列后，使用基于Mothur算法的席尔瓦数据库进行物种注释。

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数据分析 LEfSe(线性鉴别分析效应大小)软件用于比较组间差异有统计学意义的Biomarker(生物标记物)。Tax4Fun和PICRUSt软件通过将提取和注释的KEGG数据库原核生物全基因组功能信息对应到SILVA数据库中实现功能注释，并对肠道细菌的基因功能进行预测。使用Wilcoxon test对两组早产儿肠道菌群组间差异进行显著性分析，并用R软件进行绘图显示。

2 结果

2.1 基本信息比较

两组早产儿在出生体质量、胎龄、性别及出生方式上的差异无统计学意义，具有可比性(表1)。

表1 益生菌组与对照组早产儿基本信息比较

2.2 两组临床资料比较

两组早产儿临床指标结果显示，在出生第10天时，益生菌组的总胆红素、直接胆红素和血红蛋白水平低于对照组(

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<0.01)。且益生菌组的早产儿恢复出生体质量时间更短(

P

<0.05)，罹患喂养不耐受和腹泻更少(

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<0.05)。此外，益生菌组发生败血症及NEC的早产儿也更少，但差异无统计学意义(表2)。

表2 益生菌组与对照组临床资料比较

2.3 肠道菌群丰度的差异

在出生第10天时，益生菌组早产儿肠道菌群中的乳酸杆菌属(lactobacillus)和双歧杆菌属(bifidobacterium)丰度更高(

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<0.05)，而对照组的早产儿肠道菌群中梭菌属(clostridioides)、葡萄球菌属(staphylococcus)和亲铜菌属(cupriavidus)丰度更高(

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<0.05)。见图1。

图1 第10天时两组早产儿肠道菌群属水平的丰度差异

2.4 肠道菌群群落结构差异分析

使用LEfSe软件对群落结构中有统计学差异的物种进行分析，结果显示，益生菌组的群落结构生物标记物主要是双歧杆菌科(bifidobacteriaceae)和乳酸杆菌科(lactobacillaceae)，而对照组主要是毛螺旋菌科(lachnospiraceae)、瘤胃球菌科(luminococcaceae)、消化链球菌科(leptostreptococcaceae)和未分类的梭菌科(unidentified-Clostridiales)。见图2。

图2 第10天时两组早产儿肠道菌群群落结构的差异

2.5 肠道菌群功能分析

Tax4Fun结果显示益生菌组的磷酸戊糖途径(pentose phosphate pathway)、烟酸和烟酰胺代谢(nicotinate and nicotinamide metabolism)、磷酸肌醇代谢(inositol phosphate metabolism)等功能高于对照组(

P

<0.05)，而坏死性凋亡(necroptosis)功能更低(

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<0.05)。见图3。

图3 Tax4Fun肠道菌群功能预测

PICRUSt分析结果提示益生菌组的人类病原体败血症的基因功能表达低于对照组(

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<0.01)。且人类病原体肺炎、人类病原体肠胃炎和人类病原体腹泻等功能表达也低于对照组，差异均有统计学意义(

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<0.05)。见图4。

图4 PICRUSt肠道菌群功能预测

3 讨论

益生菌组早产儿中发生腹泻及喂养不耐受的风险更低，恢复出生体质量时间更短，这是因为益生菌组中乳酸杆菌和双歧杆菌含量更高，抑制了致病菌的生长，减少了腹泻和喂养不耐受的发生，也因此促进了生理体质量的尽早恢复。且双歧杆菌可以参与胆红素代谢，有助于降低早产儿的胆红素水平。有研究表明，使用益生菌的婴儿在6个月时的血红蛋白更低，而粪便中钙卫蛋白更高。更高的钙卫蛋白可能反映了肠道的中性粒细胞增加，从而参与肠道免疫系统的发育和正常菌群的形成。但粪便钙卫蛋白也被认为与肠道通透性相关。因此，推测益生菌维持肠道菌群平衡的同时，可能引起肠道通透性的轻度增高，从而导致失血、缺铁以及较低的血红蛋白水平。该实验中益生菌组早产儿在出生第10天时血红蛋白更低，可能与这一机制有关，但也不能排除孕母因素的影响，因此,需要更深入的研究。此外，益生菌组早产儿的NEC和败血症的发生率低于对照组，但差异无统计学意义，这可能是对比的标本量过少的原因。

益生菌组的双歧杆菌属和乳酸杆菌属的丰度更高。这与之前的研究结果一致。且益生菌组的梭菌属、葡萄球菌属和亲铜菌属的丰度更低。亲铜菌属是人类的机会致病菌，虽然感染人类的频率较小，但是感染后易引起败血症、脑膜炎等严重感染性疾病。有研究表明发生败血症的早产儿肠道菌群中葡萄球菌增多，且双歧杆菌减少，该研究中益生菌组的双歧杆菌属丰度增多，而葡萄球菌属减少，表明益生菌可能有利于减少早产儿败血症的发生。

之前对成人肠道菌群菌落结构的研究表明，使用益生菌后的菌落结构中瘤胃球菌科、消化链球菌科和梭菌科均减少。该实验中，使用益生菌的早产儿肠道菌群群落结构也发生了同样的变化。此外，益生菌组中的毛螺旋菌科也更少，毛螺旋菌科的肠道定植被认为有助于肥胖小鼠糖尿病的发展，因此，使用益生菌是否有利于避免早产儿后期成长过程中糖尿病的发生值得进一步研究。

叶酸是由6-羟甲基-7,8-二氢蝶呤焦磷酸盐提供的蝶呤部分和对氨基苯甲酸结合形成。而双歧杆菌通过磷酸戊糖途径制造对氨基苯甲酸。因此，该实验益生菌组的磷酸戊糖途径更高，可能与双歧杆菌属含量更高相关，并且可能有利于叶酸的合成。烟酸和烟酰胺有助于降低血胆固醇和三酰甘油。在肥胖人群中，人体肠道靶向缓释烟酸改善了系统胰岛素敏感性和代谢炎症的生物标记物。有研究表明，高脂饮食喂养导致肥胖小鼠肠道烟酸和烟酰胺代谢途径显著降低。而在该实验中，益生菌的使用则增加了早产儿肠道菌群的烟酸和烟酰胺代谢途径。此外，坏死性凋亡是一种不同于凋亡和坏死的新型细胞死亡途径，在诱导肠道时，会引起机体强烈的炎症反应。因此，益生菌的使用可能有利于减轻早产儿肠道的炎症反应。

PICRUSt分析的结果显示，益生菌组早产儿肠道菌群的人类肠胃炎、腹泻、败血症和肺炎等病原体的基因功能表达均更低，这从肠道菌群功能的方面解释了为什么益生菌减少了早产儿罹患腹泻、败血症及NEC等疾病的概率。此外，研究表明益生菌的使用可能有利于降低早产儿发生肺炎的风险。