CD98基因沉默对黑色素瘤B16-F10细胞增殖、凋亡及PI3K/AKT通路的影响

刘 静，李东宁，张晓岚，廖久棋，程茜南

黑色素瘤是已知的最恶性的皮肤癌，由正常黑色素细胞恶性转化形成，在过去的几十年中，其全球发病率稳步上升，病死率极高。如果早期诊断和治疗，黑色素瘤可以治愈，但是，转移性黑色素瘤很难治疗，大多数晚期黑素瘤对放疗和化疗反应不良，目前尚无有效的方法抑制该癌的转移扩散。转移性恶性黑色素瘤患者中位生存期约7.5个月，5年生存率约为5%。因此，探讨黑色素瘤转移的机制对改善黑色素瘤患者预后具有重要意义。

CD98是一种异二聚体跨膜糖蛋白，由重链和轻链组成，在人体内除血小板外各组织广泛分布。CD98在肿瘤细胞等增殖活跃细胞上过度表达，与肿瘤细胞的增殖和肿瘤的发生发展过程密切相关。已有研究表明，CD98在黑色素瘤中高表达，可作为黑色素瘤的生物标志物。但关于CD98对黑色素瘤的具体作用机制并不明确，该研究旨在探究CD98基因沉默对黑色素瘤B16-F10细胞增殖、凋亡及PI3K/AKT通路的影响。

1 材料与方法

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1 主要试剂

DMEM培养基(10569-010)、胎牛血清(10099-141)、胰蛋白酶(15050-057)和青-链霉素(15140-122)均购自美国赛默飞世尔科技公司；皮肤黑色素瘤细胞B16-F10购自国家模式与特色实验细胞资源库；Transwell(K914-100)购自武汉艾美捷科技有限公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒(P0010)、辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG(A0208)和Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒(C1062L)均购自上海碧云天生物技术有限公司；兔抗单克隆抗体Ki67(ab15580)、Bax(ab104156)、Bcl-2(ab59348)、Caspase-3(ab13847)、cleaved Caspase-3(ab2302)、PI3K(ab191606)、p-PI3K(ab182651)、AKT(ab106693)、p-AKT(ab192623)和GAPDH(ab9485)均购自英国Abcam公司。

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2 细胞培养

将B16-F10细胞培养于37 ℃，5% CO恒温培养箱中用高糖DMEM培养基(含10%胎牛血清和1%青-链霉素)培养，每3 d更换1次培养基，收集细胞时用0.25%胰蛋白酶消化，选用对数生长期细胞为试验用细胞。

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3 细胞处理及分组

设计3条不同的shRNA序列干扰片段(shRNA1、shRNA2、shRNA3)转染至B16-F10干扰CD98表达。通过RT-PCR实验选择最佳干扰序列shRNA3进行后续实验。细胞随机分为3组：Control组、shRNA-NC组、CD98-shRNA3组。Control组不作处理，shRNA-NC组转染空质粒，CD98-shRNA3组转染shRNA3。

1.4 RT-PCR

用TRIzol法从各组B16-F10细胞中提取总RNA，培养于37 ℃，5% CO恒温培养箱中，使用FastKing RT试剂盒通过标准反应进行mRNA的逆转录，使用Fast qPCR Mix进行实时PCR，反应条件为：95 ℃、2 min，95 ℃、15 s，55 ℃、30 s，72 ℃、15 s。以GAPDH为内参，用2方法计算。

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5 克隆形成实验

将B16-F10细胞接种至6孔板，每孔约500个细胞，按方法1.3进行分组，培养7 d后弃掉上清液，4%多聚甲醛固定20 min，0.1%结晶紫染色15 min，洗净干燥后于显微镜下观察克隆形成数目，计算克隆形成率。细胞克隆形成率(%)=细胞克隆总数/接种细胞数×100%。

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6 流式细胞仪检测细胞凋亡

取对数生长期细胞B16-F10接种于6孔板，按方法1.3分组处理，胰酶消化吸收后，PBS洗涤2次，加入500 μl缓冲液悬浮细胞，再加入5 μl磷脂酰丝氨酸蛋白混匀，最后加入碘化丙啶10 μl室温避光反应20 min通过流式细胞仪检测各组细胞凋亡。

1.7 Transwell实验

取无血清培养基稀释的人工基底膜，加入Transwell上室，37 ℃风干。取对数生长期的B16-F10细胞，按方法1.5处理分组。上室中加入200 μl的细胞悬液，下室中加500 μl的含血清的DMEM培养基。37 ℃、5% CO下培养24 h，棉签擦去基质胶和上室细胞，多聚甲醛固定后染色。光学显微镜下计数并拍照，每个样本随机选取5个视野。

1.8 Wsetern blot实验

各组细胞加入含蛋白酶抑制剂的细胞裂解液提取总蛋白，BCA法测定蛋白含量。SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白转移至PVDF膜。4 ℃下加入CD98、Ki67、PCNA、Bax、Bcl-2、Caspase-3、PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT一抗(1∶1 000)孵育过夜，TBST清洗后加入HRP-IgG(1∶10 000)，加入电化学发光显色液显色。以GAPDH为内参，ImageJ V1.8.0.112软件分析各组细胞目的蛋白与GAPDH比值。统计灰度值，目的条带相对表达量以目的蛋白与GAPDH灰度值比值表示。

2 结果

2.1 CD98表达水平

与Control组比较，3个CD98 shRNA 的CD98 mRNA水平均降低(

F

=227.5，

P

<0.05)，选择CD98-shRNA3进行后续实验；与Control组比较，CD98-shRNA3组CD98蛋白表达水平降低(

t

=1.837，

P

<0.05)。见图1。

图1 CD98 mRNA水平和蛋白表达水平

2.2 沉默CD98对B16-F10细胞增殖的影响

与Control组比较，CD98-shRNA3组克隆形成率降低(

t

=1.622，

P

<0.05)。见图2。

图2 沉默CD98对B16-F10细胞增殖的影响 ×200

2.3 沉默CD98对B16-F10细胞Ki67、PCNA蛋白表达水平的影响

与Control组比较，CD98-shRNA3组Ki67、PCNA蛋白表达降低(

t

=1.113、1.286，

P

<0.05)。见图3。

图3 沉默CD98对B16-F10细胞增殖蛋白的影响

2.4 沉默CD98对B16-F10细胞凋亡的影响

与Control组比较，CD98-shRNA3组细胞凋亡率升高(

t

=1.147，

P

<0.05)。见图4。

图4 沉默CD98对B16-F10细胞凋亡的影响

2.5 沉默CD98对B16-F10细胞Bax/Bcl-2、cleaved Caspase-3/Caspase-3值的影响

与Control组比较，CD98-shRNA3组Bax/Bcl-2、cleaved Caspase-3/Caspase-3比值升高(

t

=1.002、1.933，

P

<0.05)。见图5。

图5 沉默CD98对B16-F10细胞Bax、Bcl-2、Caspase-3蛋白表达水平的影响

2.6 沉默CD98对B16-F10细胞侵袭的影响

与Control组比较，CD98-shRNA3组侵袭细胞数降低(

t

=1.533，

P

<0.05)。见图6。

图6 沉默CD98对B16-F10细胞侵袭的影响 ×200

2.7 沉默CD98对B16-F10细胞p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT比值的影响

与Control组比较，CD98-shRNA3组p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT值降低(

t

=1.105、1.176，

P

<0.05)。见图7。

图7 沉默CD98对B16-F10细胞PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT蛋白表达水平的影响

3 讨论

尽管总体癌症发病率正在下降，但黑色素瘤的发病率仍继续以每年约3%的速度增长，黑色素瘤是一个严重的公共卫生问题，带来了沉重的经济负担。CD98通过其重链CD98hc与整合素相互作用，调控细胞增殖、存活、迁徙、上皮细胞黏附性及极向，在喉部鳞状细胞癌、肺腺癌、乳腺癌及肾细胞癌等恶性肿瘤中高表达。

该研究表明，沉默CD98可降低B16-F10细胞克隆形成率和Ki67、PCNA蛋白表达水平。在黑色素细胞向黑色素瘤细胞转变过程中，黑色素细胞增殖异常，其增殖能力决定着黑色素瘤的进展和预后。Ki67是增殖细胞核中的非组蛋白性核蛋白，在细胞周期中可识别细胞核抗原，其表达水平的高低可以指示黑色素瘤细胞增殖的变化。PCNA是一种与细胞增殖状态相关的核蛋白，其表达水平随着临床分期和淋巴节转移的增加逐渐升高，可指示细胞增殖和所处周期。相关研究表明，通过使用CD98抑制剂在体内和体外均可抑制细胞增殖和肿瘤生长。提示沉默CD98可抑制B16-F10细胞增殖。

癌细胞凋亡降低是黑色素瘤重要的生物学特征，调控细胞凋亡是治疗黑色素瘤的必要方式。促凋亡蛋白Bax和抗凋亡蛋白Bcl-2可相互作用，其形成的复合物比值的高低可判定细胞凋亡状态。Caspase家族处于细胞凋亡过程中的核心地位，可通过与多种蛋白因子相互作用调节细胞凋亡，其中Caspase-3在凋亡级联中过度活化能够促进细胞凋亡。该研究表明，沉默CD98升高B16-F10细胞凋亡率和Bax/Bcl-2、cleaved Caspase-3/Caspase-3值的作用。提示沉默CD98诱导B16-F10细胞凋亡。

侵袭和转移是影响黑色素瘤生存的首要因素也是治疗的最大障碍。贾国战 等研究表明CD98通过增强人类肝癌细胞的黏附及迁徙能力，促进肝癌的侵袭和转移。张磊 等研究表明CD98可能通过上调CD147的表达来调控结直肠癌的侵袭转移。该研究表明，沉默CD98具有抑制B16-F10细胞侵袭的作用。

PI3K/AKT信号通路与肿瘤、炎症、自身免疫性疾病等的发生发展密切相关，其可被多种细胞因子激活，调节细胞增殖、分化、翻译及转录等基本功能。相关研究表明，大多数黑色素瘤中存在AKT的异常活化，异常活化的PI3K/AKT信号通路能增加恶性黑色素瘤细胞的运动能力，促进了黑色细胞转移和侵袭。该研究表明，沉默CD98具有降低B16-F10细胞p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT比值的作用。