基于网络药理学探讨姜黄-白芍治疗类风湿关节炎协同机制

凌 益，徐 晖，黄 颖，任妮娜，唐 芳，姚血明，陆道敏，马武开

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是一种侵蚀性多关节炎为主要症状的自身免疫性疾病。RA中国大陆发病率为0.42%，患病人群约500万，男女患病比率约为1∶4。RA的发病机制尚不明确，姜黄-白芍药对具有破血行气，通经止痛的功效，其是治疗RA的常用中药。现代药理研究表明姜黄、白芍均可通过抗氧化、抗炎、镇痛、调节免疫等途径治疗RA。因成分多、作用复杂，姜黄、白芍各自的单体研究不能确切体现该药对防治RA的功效。网络药理学是以生物信息数据为基础，综合药理学和生物活性等学科的知识和方法，探讨药物作用于疾病的可能机制。利用网络药理学方法和分析手段，探索姜黄-白芍治疗RA可能的协同机制，为后续实验提供参考。

1 材料与方法

1.1 姜黄-白芍活性成分的筛选

在中药系统药理学数据库和分析平台(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database，TCMSP，http://lsp.nwsuaf.edu.cn/tcmsp.php/)分别检索“姜黄”、“白芍”，获得2味中药所有化合物成分。根据各化合物ADME(吸收、分布、代谢、排泄)性质的结果，以口服生物利用度(oral bioavailability，OB)和药物相似度(drug likeness，DL)作为化合物成分的筛选条件，以OB≥30%、DL≥0.18筛选出姜黄、白芍活性化合物。此外，将已明确具有防治RA作用，但不满足OB和DL条件的化合物同样纳入姜黄-白芍的活性化合物中。

1.2 姜黄-白芍活性成分靶点的筛选

在TCMSP 数据库中，根据活性成分获取相应靶蛋白，将获得靶蛋白输入UniProt数据库(http://www.uniport.org/)检索，得到标准化基因名。另外，将活性成分输入PubChem(http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)数据库中查询其对应的SMILES，在SwissTargetPrediction数据库(http://www.swisstargetprediction.ch/)输入活性成分的SMILES，获得活性成分的靶蛋白及基因名。将上述两个数据库获得的靶蛋白结果取并集，即为相应活性成分的靶蛋白，并整理为相应标准化基因名。将筛选出姜黄、白芍活性成分及相应的靶蛋白基因输入Cytoscape 3.7.1软件中，构建出药物-成分-靶点网络；然后使用network analyzer功能进行网络特征分析，根据degree的数值，预测该节点的重要性。

1.3 RA靶点基因的筛选

在GeneCards数据库、人类基因和基因表型综合数据库(online mendelian inheritance in man，OMIM)、比较毒物遗传学数据库(the comparative toxicogenomics database，CTD)中检索关键词“rheumatoid arthritis”，获取RA的疾病相关靶点，并将靶点在UniProt数据库转化为相应的标准化基因名。

1.4 药物有效成分和RA疾病共同靶点筛选

将姜黄-白芍药对有效成分靶基因和RA疾病靶基因同时录入VENNY 2.1(http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)在线作图案软件，进行映射后构建韦恩图，得到姜黄靶基因、白芍靶基因及RA靶基因相互间的交集基因，其中它们三者之间共同的交集基因是姜黄-白芍药对有效成分和RA联系的靶点基因，其可能是姜黄-白芍药对发挥协同治疗的节点。

1.5 靶蛋白相互作用网络

利用STRING数据库在线软件(https://string-db.org/)构建蛋白-蛋白相互作用(protein-protein interaction，PPI)网络模型。选择Mutiple Protein，将三者间交集基因输入，蛋白种属选人类即“Homo sapiens”，最低相互作用阈值选定为中等“medium confidence(0.400)”，其他参数均保持默认设置，获得PPI网络数据，将结果以TSV格式导出，利用Cytoscape 3.7.1软件绘制相互作用网路，并对网络进行分析。

1.6 姜黄-白芍药对对RA靶点作用的生物过程富集及通路富集

利用Cytoscape 3.7.1中的CluoGo插件，对三者间共同交集基因进行京都基因(geneontology，GO)生物学过程富集分析，对姜黄与RA交集基因和白芍与RA交集各自进行基因组百科全书(kyoto encyclopedia of genes and gnomes，KEGG)通路富集分析，物种选为“Homo sapiens”，以

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<0.05作为显著功能和通路的临界值，获取相应数据，以条形图和气泡将其可视化。

2 结果

2.1 姜黄-白芍活性成分和相应靶点

通过TCMSP数据库共获取有137个化合物，其中52个属于姜黄，85个属于白芍。以OB≥30%和DL≥0.18作为条件筛选活性化合物，姜黄共筛选到3个活性化合物，白芍共筛选到12个活性化合物。经过查阅相关文献，具有明确防治RA的Demethoxycurcumin(去甲氧基姜黄素)、Ar-turmerone(芳姜黄酮)、Curcumin(姜黄素)3个化合物虽然不满足上述ADME筛选条件，但是仍将其归入姜黄的活性化合物，故姜黄活性化合物共6个。最终获得姜黄活性化合物6个，白芍活性化12个，即姜黄-白芍药对共18个潜在活性化合物，其基本信息见表1。根据18个潜在活性化合物，在TCMSP数据库和SwissTargetPrediction数据库经相应检索后，删除重复靶点蛋白和非人类靶点蛋白，共获得姜黄-白芍靶点蛋白445个，其中278个属于姜黄，290属于白芍，重复123个。其中化合物N15、N16、N17、N18目前无对应靶点蛋白，故从活性成分中剔除。

表1 符合筛选标准OB和DL的活性化合物表

利用Cytoscape 3.7.1软件，构建出药物-成分-靶点网络，见图1。其中矩形分别代表药物，菱形分别代表姜黄、白芍各自的活性成分，椭圆形分别代表为姜黄单独靶点、姜黄-白芍共有靶点和白芍单独靶点，边代表药物、活性成分和靶蛋白的相互作用。该图中节点共460个，平均degree为3.861。其中活性成分中degree值排名前三成分为Kaempferol(山奈酚)、Curcumin、Demethoxycurcumin，其degree值分别为166、109、100，它们可能为姜黄-白芍药对治疗疾病的主要成分。靶点蛋白基因degree数值较高的基因为CYP19A1、PGR、NR3C1、SHBG、ESR1、AR、NCOA2，表明姜黄-白芍药对可能主要作用于上述关键靶点基因发挥药物疗效。该网络体现了一个活性成分可对应多个靶点蛋白，一个靶点蛋白可对应多个活性成分，姜黄-白芍药对防治疾病是个复杂的过程。

图1 药对-活性成分-靶点蛋白基因网络

2.2 RA基因与姜黄-白芍药对基因的交集

通过查询上述3个疾病数据库得到RA相关基因2 060个，利用UniProt数据将相关基因标准化。将姜黄、白芍各自活性成分靶蛋白基因与RA基因输入VENNY 2.1在线作图案软件，姜黄与RA共有98个交集基因，白芍与RA共有136个交集基因，姜黄、白芍、RA三者共有53个交集基因，所得韦恩图见图2。三者共同交集基因列表见表2。利用Cytoscape 3.7.1软件，构建出药物-有效成分-靶点基因-疾病的网络，见图3。该网络表明姜黄-白芍药对可能通过Stigmasterol(植物甾醇)、Campesterol(菜油甾醇)、CLR(胆固醇)、Demethoxycurcumin、Ar-turmerone、Curcumin、Mairin(白桦脂酸)、Beta-sitosterol(beta-谷甾醇)、Sitosterol(谷甾醇)、Kaempferol、(+)-catechin(儿茶素)、Palbinone(芍药二酮)、Paeoniflorin(芍药苷)这13个活性成分，对53个靶点蛋白反应，协同RA的治疗。

图2 药物靶点蛋白基因-疾病基因的韦恩图

图3 药物-有效成分-靶点基因-疾病网络

表2 药对活性成分作用基因与RA基因交集表

2.3 PPI网络构建和分析

53个交集基因构建网络图，见图4。其中网络图共有53个节点，277个边，degree值越大，则节点越大，填充颜色越深。将degree值大于16的基因绘制柱状图，见图5。其中degree数值较大排名前三的基因为AKT1、TNF、PTGS2，表明姜黄-白芍药对主要通过上述3个基因对RA起协同治疗作用。

图4 PPI网络图

图5 基因与degree柱状图

2.4 GO富集和KEGG富集分析

将筛选得到的53个靶基因进行GO和KEGG通路分析。设定阈值

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<0.05，选取靠前的富集结果，对生物过程(biological process，BP)、分子功能(molecular function，MF)和细胞组分(cellular component，CC)进行分析。靶基因在BP富集过程有194个，选取Pvalue最小的10生物过程作图，见图6，主要表现在炎性反应调节(regulation of inflammatory response)、核受体活性(nuclear receptor activity)、配体激活转录因子活性(ligand-activated transcription factor activity)、类固醇激素受体活(steroid hormone receptor activity)、小分子代谢过程正向调节过程(positive regulation of small molecule metabolic process)等生物过程。靶点基因在MF富集过程有30个，选取Pvalue最小的10生物过程作图，见图7，主要表现在配体激活转录因子活性(ligand-activated transcription factor activity)、类固醇结合(steroid binding)、单加氧酶活性(monooxygenase activity)、一氧化氮合酶调节活性(nitric-oxide synthase regulator activity)等分子功能。靶点基因在CC富集过程仅有1个，为核封套管腔(nuclear envelope lumen)。姜黄与RA交集基因姜黄基因KEGG通路富集为28条通路，白芍与RA交集基因KEGG通路富集为74条通路，它们共有24条通路重叠，这24条重叠的通路可能为姜黄、白芍起协同作用的通路，作气泡图(以基因数与总基因数比值为横坐标，基因数越多点越大，

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值越小颜色越深)，结果见图8。上述结果表明姜黄-白芍协同治疗RA涉及生物过程、分子功能和细胞组分及通路过程中，它可能为多成分、多靶点、多通路的1个复杂的生化过程。

图6 药对治疗RA的BP富集分析

图7 药对治疗RA的MF富集分析

图8 药对治疗RA的KEGG通路

3 讨论

从药物-成分-靶点-疾病网络图中可以看出，姜黄-白芍药对对RA治疗具有协同作用的活性成分有13个，以姜黄素、去甲氧基姜黄素、山奈酚为主。其中，姜黄素的活性氧清除功能是通过调控环氧合酶(COX)和核转录因子κB(nuclear factor-kappa B，NF-κB)发挥抗氧化作用，下调氧化应激导致炎性反应，或者通过核转录因子、Toll样受体4(toll-like receptor 4，LR4)信号转导、细胞外调节蛋白激酶(Erk1/2)等途径调节白介素(interleukin，IL)-1、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12、髓样分化初级应答蛋白88(myeloid differentiation primary response protein 88，MyD88)、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)等抑制炎性反应，还能活化通路磷脂酰肌醇3-激酶/第10号染色体同源缺失性磷酸酶-张力蛋白/蛋白激酶B(PI3K/AKT/mTOR)通路，抑制环氧化酶-2(COX-2)和B细胞淋巴瘤因子2(B cell lymphoma-2，Bcl-2)表达，促进细胞凋亡，最终姜黄素通过多途径改善RA。去甲氧基姜黄素为姜黄素的衍生物，可抑制IL-1、TNF-α等炎性因子释放，调节胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)-3诱导细胞凋亡，缓解RA症状，或下调金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)-2和MMP-9表达，减少Ⅳ型胶原降解，抑制滑膜细胞的迁移和侵袭能力。山奈酚属于黄酮类物质，一方面具有抗氧化应激功能，减少氧化应激导致炎性反应的发生，另一方面能通过线粒体凋亡通路和PI3K/AKT/mTOR通路促进RA相关细胞凋亡。故姜黄-白芍药对的多个有效成分可以通过抗氧化、调节炎性反应、促进细胞凋亡等多种途径对RA发挥作用。

从PPI网络图中可以看出，姜黄-白芍药对对RA起治疗作用的基因中，自由度最高的前三靶点为AKT1、TNF、PTGS2。AKT1是蛋白激酶(AKT)的3种亚型之一，是多条信号通路的一个重要交叉点，可被激素、生长因子、细胞因子、细胞间基质等物质活化，活化的AKT引起下游磷酸化级联反应和靶蛋白之间的相互作用，如AKT活化作用于Bcl-2、Caspases-9与细胞凋亡相关，AKT活化作用于mTOR与自噬相关，AKT活化参与TNF-α、IL-6、IL-17、IL-21、IL-22的表达，AKT与滑膜细胞生长、增殖、凋亡、自噬、迁移等多种细胞活动和生物学效应相关，直接或间接影响RA。TNF与RA相关研究最多的为TNF-α，TNF-α与其受体(TNFRs)形成的TNF-TNFRs系统不仅能诱导细胞凋亡，还能促进细胞增值、分化、成熟，TNF-TNFRs系统失衡与RA发生密切相关。此外，TNF-α经NF-κB等途径产生炎性因子、血管内皮生长因子(VEGF)、MMPs导致炎性反应、血管翳形成、骨质破坏也是RA进展的原因。PTGS2即COX-2，前列腺素(PG)的合成随着降低COX-2活性降低而减少，PG在滑膜组织中主要源于RA滑膜，并且引起RA的疼痛。故姜黄-白芍可以通过AKT1、TNF、PTGS2等靶向共同调节RA治疗。

从富集分析表明，姜黄-白芍药对在RA治疗是配体激活转录因子、类固醇、单加氧酶、一氧化氮合酶等物质对炎性反应、核受体活性、配体激活转录因子活性、类固醇激素受体活性、小分子代谢过程等生物过程的调节，涉及细胞膜、细胞器、细胞核的一个复杂的过程。KEGG通路富集分析表明，癌症相关通路、糖尿病并发症的AGE-RAGE信号通路，缺氧诱导因子1(HIF-1)信号通路，TNF信号通路，IL-17信号转导等通路涉及药对治疗RA。研究表明RA成纤维样细胞异常增生，并展现出了类癌细胞特点，RA成纤维细胞样滑膜细胞异常增生可能与癌症相关通路有关联，该药对可通过癌症相关通路对RA发挥治疗作用。糖尿病并发症的AGE-RAGE 信号通路与氧化应激反应相互作用，活化NF-κB，调节细胞凋亡，在RA形成中扮演重要角色。在HIF-1信号通路中，HIF-1能够介导Th1和Th17 细胞的生成，导致一些列炎性反应。TNF信号通路，IL-17信号通路中，受体相互作用蛋白经各种通路介导炎症发生。由此可推测，姜黄-白芍通过抗氧化应激反应，抑制炎性反应，改善机体免疫功能和调节细胞凋亡等机制协同治疗RA。