miR-513a-3p在结肠癌中高表达并诱导细胞生长和迁移的机制研究

缪作华，刘素云，李 丹

结肠癌(colorectal cancer，CRC)是全球第三大常见癌症，也是常见的癌症相关死因之一。既往研究表明，肿瘤抑制基因的失活和致癌基因的激活均有可能导致CRC发病，这些功能基因被很多分子调控，比如多种MicroRNAs(miRNAs)在CRC发病中发挥着重要的作用。miRNAs是一种长度在19～24个核苷酸之间小型的非编码RNA，通过与靶蛋白mRNA3′端非编码区(3′-UTR)结合，导致靶蛋白翻译抑制，靶蛋白可影响细胞的生物学作用，因而miRNAs在细胞生长、增殖、凋亡和分化等多种生物学过程中发挥着重要作用。miR-513a-3p作为miRNAs中一员，被证实介导了多种肿瘤增殖。关于CRC与miR-513a-3p相关报道较为少见，其作用机制也尚未明确。因此，该研究通过观察CRC患者癌组织与肺癌组织miR-513a-3p的差异，证实CRC发病与miR-513a-3p异常表达的关系，再用人CRC细胞株HT-29和SW480细胞进行体外实验，初步探究miR-513a-3p对CRC细胞生长和迁移的诱导机制。

1 材料与方法

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1 病例资料

收集2018年10月—2019年4月在该院确诊为CRC患者的CRC组织及癌旁正常组织30例作为研究对象，男女比例为17∶13，年龄为(58.32±12.47)岁。入选条件：术前未接受放射性治疗、化疗或者药物治疗。手术切除CRC变组织和临近非癌变组织，各选取1～2 cm漂洗干净后放置于4%多聚甲醛中固定，其余部分液氮中速冻留用。实验中所涉及的患者均经本人或家属同意，并签署知情同意书，且经医院伦理委员会审核后实行研究。

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2 试剂与仪器

人CRC细胞株HT-29(HTB-38)和SW480(cl-228)购自美国菌种保藏中心ATCC；miR-454-3p探针由上海吉玛制药技术有限公司构建；10%胎牛血清购自上海前尘生物科技有限公司；胃蛋白酶购自深圳市文乐生物科技有限公司；NTE缓冲液购自北京沃凯生物科技有限公司；SCS缓冲购自液深圳市文乐生物科技有限公司；地高辛抗体购自北京拜尔迪生物技术有限公司；DAB显色剂购自北京绿源大德生物科技有限公司；TRIzol试剂盒购自北京中成谨念科技有限公司；反转录试剂盒购自武汉科尔普生物科技有限公司；SYBR Green PCR 混合试剂盒购自成都柏诺科技有限公司。

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3 实验方法

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细胞培养 培养在含10%胎牛血清(FBS, Gibco，10099141)和1%双抗(Gibico，1566407)的DMEM(Hyclone, 8118174)高糖完全培养基中，放置于37 ℃，5% CO培养箱内培养，每2～3 d传代并更换培养液。

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miR-513a-3p表达的检测 ① 原位杂交检测miR-513a-3p在组织中的表达水平。将组织从4%多聚甲醛中拿出，进行常规脱水、浸蜡和石蜡包埋后，6 μm切片，二甲苯脱蜡处理，然后用高浓度到低浓度的乙醇水化，放入30%过氧化氢和蒸馏水1∶10 混合液中(25 ℃，5～10 min)灭活内源性酶，滴加3%枸橼酸新鲜稀释的胃蛋白酶，37 ℃消化15 min，1%多聚甲醛/0.1 mol/L的PBS，含有1/1 000 DEPC，室温后固定10 min，洗净后42 ℃预杂交2～4 h，随后滴加30 μl 探针杂交液。42 ℃ 湿盒孵育过夜，SSC振荡漂洗、NTE缓冲液漂洗。37 ℃封闭30 min，滴加地高辛抗体37 ℃封闭60～120 min，随后SABC、生物素化过氧化物酶分别处理，DAB显色，显色后冲洗，乙醇脱水，透明后封片。② miR-513a-3p相对表达水平的检测。取冻存的组织(或者细胞)标本，严格按照TRIzol试剂盒的说明书提取组织中总RNA，再根据反转录试剂盒说明书将RNA反转录为cDNA，最后把其作为模板通过qRT-PCR检测miR-513a-3p的表达水平，上海生工生物工程(上海)股份有限公司协助完成引物设计和合成，严格按照SYBR Green PCR 混合试剂盒操作要求进行定量操作。miR-513a-3p正向和反向引物分别是5′-TAAATTTCACCTTTCTGAGAAGG-3′和5′-GCGAGCACAGAATTAATACGAC-3′；U6作为内参，它的正向和反向引物分别为5′-CTCGCTTCGGCAGCAA-3′和5′-AACGCTTCACGATTTGCGT-3′。使用2法进行定量计算，实验重复3次。

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人CRC细胞株HT-29和SW480细胞转染miR-513a-3p 将细胞株分别接种于96孔板中，37 ℃，5% CO培养箱内培养24 h，细胞密度达到50%～70%时参照Lipofectamine 2000 试剂(Invitrogen)说明书将miR-513a-3p 模拟物(miR-513a-3p mimics)(促进表达组)及阴性对照(miR-513a-3p NC)(阴性对照组)转染于细胞株。

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MTT法检测转染miR-513a-3p后细胞的活力 将转染后的细胞接种于96孔板中，培养箱中分别培养1、2、3、4 d后，倒去旧的培养基，各孔加入基础培养基稀释好的MTT，使得最终每孔MTT终浓度为0.5 mg/ml，100 μl每孔，相同条件下继续培养4 h。最后倒去旧培养基，每孔加入150 μl的DMSO。置于酶标仪中中速振荡10 min，以加速结晶溶解，在490 nm处测定吸光度值。

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细胞克隆实验观察转染miR-513a-3p后细胞的增殖能力 将转染后的细胞消化充分并吹打至单个细胞，然后接种到铺好琼脂糖及细胞培养液的6孔板中(细胞200个/孔)，培养箱中培养7 d后，4%多聚甲醛固定细胞15 min，PBS洗2～3遍后0.1%结晶紫溶液染色15 min，镜下观察细胞集落(细胞数量>20个)的数目。

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细胞划痕实验观察转染miR-513a-3p后细胞的迁移能力 种板前用标记笔在6孔板外侧底部，用直尺均匀地画4条直线；细胞5×10个/孔接种于6孔板，贴壁长满后，倒掉培养液，用200 μl移液枪头在底部中央作一直线划痕，PBS洗3次去除细胞表面残骸和碎片，分别在培养0、12、24 h后观察细胞迁移情况，并拍照记录。每孔沿划痕从上到下观察6个视野，每组3个复孔共18个视野。

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Transwell实验检测转染miR-513a-3p细胞的侵袭能力 细胞饥饿24 h后充分消化，接种到transwell小室(稀释的Matrigel基质胶包被)基底膜的上室表面，接种密度1×10个/室，下层小室内为10%含血清完全培养基，37 ℃培养24 h后, 4%多聚甲醛固定后0.1%结晶紫染色细胞，显微镜下选5个视野计数穿出细胞数目。

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NF-κB和Wnt/β-catenin通路相关蛋白表达的检测 提取HT-29和SW480细胞中的蛋白，随后用BCA蛋白检测试剂盒检测蛋白浓度，样品定量后上样，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离(SDS-PAGE)凝胶，然后按照“三明治”标准进行转膜，300 mA恒流60 min，封闭后分别于4 ℃孵育p-p65(ab16502)、p65(ab86299)、p-IκBα(ab92700)、IκBα(ab32518)、Wnt3a(ab28472)、Wnt5a(ab72583)、β-catenin(ab32572)和β-actin(ab8226)一抗4 ℃孵育过夜，二抗(CST，#7076)室温孵育1 h，最后使用化学发光仪曝光，所得条带的蛋白灰度值采用Image-J进行分析，按目的蛋白/内参相对灰度值作为分析结果。

2 结果

2.1 组织中miR-513a-3p的表达

原位杂交检测结果显示(图1A)，CRC组织miR-513a-3p阳性表达(棕色区域)较癌旁组织增加。qRT-PCR检测结果显示(图1B)，CRC组织miR-513a-3p相对表达量较癌旁组织升高(

t

=12.357，

P

<0.01)。

图1 CRC组织中miR-513a-3p的表达

2.2 miR-513a-3p过表达促进细胞增殖能力

促进表达组的HT-29和SW480细胞miR-513a-3p相对表达量均高于阴性对照组(

t

=16.371、13.579；均

P

<0.01)，提示miR-513a-3p在HT-29和SW480细胞中转染成功(图2A)。阴性对照组和促进表达组的HT-29细胞活力在1、2、3、4 d时间中逐渐升高(

F

=8.761、21.459；均

P

<0.01；图2B)，阴性对照组和促进表达组的SW480细胞活力在1、2、3、4 d时间中亦逐渐升高(

F

=8.136、18.673；均

P

<0.01；图2C)。与阴性对照组比较，促进表达组细胞活力在3、4 d两个时间段中均升高(

t

=9.962、12.918；均

P

<0.01)。

图2 miR-513a-3p过表达促进细胞增殖能力

2.3 miR-513a-3p过表达对细胞迁移能力的影响

与阴性对照组比较，促进表达组的HT-29和SW480细胞侵袭细胞比例增加(

t

=43.675、36.782；均

P

<0.01；图3A、B)。促进表达组HT-29和SW480的细胞迁移能力增强，划痕面积愈合快(图3C)。

图3 miR-513a-3p过表达对细胞迁移能力的影响

2.4 miR-513a-3p过表达对NF-κB和Wnt/β-catenin通路的影响

Western blot结果如图4所示，与阴性对照组比较，促进表达组的HT-29细胞p-p65和p-IκBα、Wnt3a、Wnt5a和β-catenin蛋白相对表达量均升高(

t

=14.719、14.878、8.957、9.137、9.132；均

P

<0.01)，促进表达组的SW480细胞p-p65和p-IκBα、Wnt3a、Wnt5a和β-catenin蛋白相对表达量均升高(

t

=15.134、15.579、5.362、6.964、10.950；均

P

<0.05)，提示miR-513a-3p过表达两种细胞的p65/p-IκBα通路、Wnt/β-catenin通路均被激活。

图4 miR-513a-3p过表达对NF-κB和Wnt/β-catenin通路的影响

3 讨论

全球每年有100多万CRC新确诊病例，CRC不仅加重社会和家庭经济负担，且严重威胁到患者的生命健康。CRC早期临床症状并不明显，部分CRC患者确诊时已发展到中晚期，这给予临床治疗带来巨大的挑战。另一方面，随着医疗技术不断进步，以手术、化疗和放射治疗等治疗手段为主治疗CRC，虽然有效改善CRC患者的生存和预后情况，但患者病死率依旧居高不下，每年仍有约60.8万人死亡。因此，开展CRC相关研究探讨其分子引起的发病机制，以期为CRC寻求治疗药物或治疗靶点具有重要的意义。该研究旨在观察miR-513a-3p在CRC组织及癌旁正常组织表达差异，初步探究miR-513a-3p与CRC发病机制的关系。

既往研究表明miRNAs参与介入几乎所有类型的癌症和恶性肿瘤，而CRC患者中或CRC组织中也有多种miRNAs异常表达。多项研究中表明miR-513a-3p充当“癌基因”的角色，其高表达能促进癌症发生发展，与上述结果相似，该研究应用原位杂交和qRT-PCR检测CRC组织和癌旁正常组织的miR-513a-3p表达情况，结果显示CRC组织miR-513a-3p均高于癌旁组织，提示miR-513a-3p过表达可能增加CRC发生风险。癌症易扩散、易复发归因于癌细胞增殖快、迁移侵袭能力强等恶性特征，基于以上结果可以推测，miR-513a-3p过表达可能通过影响癌细胞增殖、迁移、侵袭等恶性特征参与CRC发病机制，为了验证以上推论，该研究利用两种不同来源的癌细胞株转染miR-513a-3p类似物，以达到miR-513a-3p过表达的目的，结果显示，促进表达组miR-513a-3p相对表达量明显高于阴性对照组，表明实验转染成功。进一步检查细胞活力、迁移能力和侵袭能力显示，促进表达组细胞活力增高，迁移和侵袭能力明显增强，结果提示过表达的miR-513a-3p能够促进癌细胞增殖、迁移和侵袭作用。

上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)赋予细胞迁移和侵袭性，EMT参与CRC的迁移进程，而Wnt/β-catenin信号通路参与调控EMT的过程，Wnt/β-catenin信号途径被激活时，E-cadherin/catenin 复合物稳定性遭到破坏而发生一系列生物学作用，最终会导致EMT的发生。该研究采用Western blot检测两种癌细胞Wnt/β-catenin信号通路相关蛋白显示，促进表达组Wnt3a、Wnt5a和β-catenin蛋白相对表达量均较阴性对照组升高，提示Wnt/β-catenin信号通路活化，过表达的miR-513a-3p可能通过调控Wnt/β-catenin信号通路表达促进癌细胞迁移和侵袭作用。研究显示NF-κB信号通路在抑制CRC细胞增殖中也扮演重要的角色。该研究结果显示，促进表达组Wnt3a、Wnt5a和β-catenin蛋白相对表达量均升高，促进表达组p-p65和p-IκBα蛋白相对表达量均较阴性对照组升高，提示NF-κB信号通路活化，过表达的miR-513a-3p可能通过调控NF-κB信号通路表达促进癌细胞增殖作用。

综上所述，miR-513a-3p在CRC组织中的表达升高，细胞实验证实过表达的miR-513a-3p能促进人CRC细胞株HT-29和SW480的生长和迁移，其作用机制可能与NF-κB和Wnt/β-catenin通路的激活相关。