容积激活性氯离子通道蛋白ClC-3表达下调促进H9c2心肌细胞肥大及其机制研究

孙 宇，陈梦青，汪 帅，李艳文，喻 阳，李咏琪，李春梅

心肌肥大的主要特点是心肌细胞体积增大，易引发心律失常，最终导致心力衰竭和心肌梗死等疾病。ClC-3是电压门控氯通道基因家族成员之一，在心脏、脑等组织中广泛表达。许多研究表明，ClC-3的功能具有多效性，包括作为容积调节性氯离子通道的关键组成部分，能调节细胞体积，保护心肌细胞免受低氧、缺血或肥大时细胞体积过度增加的影响。前期研究表明异丙肾上腺素能诱导大鼠原代心肌细胞、H9c2细胞和C57小鼠ClC-3表达降低，且AAV-9介导的ClC-3过表达小鼠能明显抑制异丙肾上腺素诱导的心肌肥厚。该研究利用siRNA转染H9c2心肌细胞构建ClC-3表达下调模型，观察其对心肌细胞的影响及机制，为研究ClC-3在心脏中的功能提供借鉴，同时也为临床心肌肥大的防治提供思路。

1 材料与方法

1.1 细胞与主要试剂

H9c2细胞购自上海中国科学院细胞库。异丙肾上腺素(ISO)购自美国Sigma公司。ClC-3一抗购自英国Abcam公司。siRNA ClC-3及转染试剂盒购自苏州瑞博生物有限公司。Bradford蛋白浓度试剂盒、JC-1线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential，MMP)试剂盒、细胞骨架染色α-Tubulin一抗均购自北京碧云天生物技术有限公司。DMEM培养基、FBS胎牛血清、0.25%胰酶均购自上海Gibco公司。TRIzol购自大连TaKaRa生物公司。PCR引物由上海生工生物工程有限公司设计并合成。Prime ScriptTMRT Reagent及SYBR PCR Mix购自日本ToYoBo公司。

1.2 主要方法

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细胞培养及分组 大鼠H9c2心肌细胞株在含10%的胎牛血清的DMEM培养基中培养，每2 d更换1次。在37 ℃、5% CO的培养箱中培养传代，取对数期、生长良好的细胞进行实验。将2×10个细胞接种于6孔板中，待细胞融合度达到60%～70%时进行转染。加入小干扰RNA在培养箱中转染48 h和72 h后，更换为完全培养基继续培养48 h，采用qRT-PCR和Western blot检测转染效率。实验主要分为4组：空白组、siRNA空载对照组、肥大模型组：ISO(10 μmol/L诱导心肌肥大)以及siRNA转染敲低ClC-3组。

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2

Western blot检测ClC-3蛋白表达 H9c2细胞经100 nmol/L的siRNA转染不同时间后，提取蛋白，并用Bradford法测定蛋白浓度。加入上样缓冲液后，用SDS-PAGE电泳分离蛋白样品，转膜后用奶粉封闭2 h。4 ℃孵育一抗，过夜后室温孵育二抗。采用ECL化学发光法检测。各组蛋白均以GAPDH作为内参校正。

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2

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3

α

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Tubulin免疫荧光染色 将生长状态良好的H9c2细胞经胰蛋白酶消化后，接种于带有细胞小圆玻片的48孔板中，每孔200 μl，计数后调节细胞浓度约8×10个/孔，培养24 h细胞贴壁后，进行饥饿处理12 h，细胞换液按分组分别处理48 h后，弃去培养基，PBS洗3次，每次5 min，用4%的多聚甲醛固定15 min，弃固定液，PBS洗3次，室温封闭1 h，然后加入α-Tubulin(1∶100)一抗4 ℃过夜。第2天加入羊抗鼠二抗室温避光孵育1 h，DAPI染色，PBS洗3次后封片，荧光显微镜拍照，用Image Pro Plus 6.0进行图像处理和分析。

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总RNA提取和qRT

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PCR检测mRNA表达水平

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1

mRNA提取 细胞按2×10个/孔的密度接种于6孔板中，每孔给予每组相应处理后加入TRIzol试剂裂解细胞。用细胞刮刮下细胞，收取细胞悬液于1.5 ml EP管中，振荡1 min,使细胞完全裂解。加入氯仿，剧烈振荡15 s，混匀后室温放置3 min，12 000 r/min，4 ℃离心15 min，取上清液加异丙醇，颠倒混匀，室温静置10 min，12 000 r/min，4 ℃离心10 min，弃上清液，加75%的乙醇进行洗涤，7 500 r/min，4 ℃离心5 min，弃上清液，倒扣EP管在洁净的滤纸上，室温静置20 min。加入10 μl的DEPC水冰上溶解，吹打混匀后分光光度计测定RNA浓度和纯度。

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2

qRT-PCR检测 按逆转录试剂盒(QPS-201)说明书反转录后，以GAPDH为内参，RT-PCR检测心肌组织ANP、BNP、β-MHC的相对表达量。引物序列如下：ANP上游引物5′-TACGAGACAGTGACGGACAA-3′，下游引物5′-GAAGAAGCCCAGGGTGAT-3′；BNP上游引物5′-CAGCTCTCAAAGGACCAAGG-3′，下游引物5′-CGATCCGGTCTATCTTCTGC-3′；β-MHC上游引物5′-GGGTATCCGCATCTGTAGGA-3′，下游引物5′-CCTTTCCGGCTATCAATGAA-3′；ClC-3上游引物5′-AGACATTGCTGCTGACTGGA-3′，下游引物5′-CCCTCTCTTCAAACGTCGTC-3′；GAPDH上游引物5′-AGGAGTAAGAAACCCTGGAC-3′，下游引物5′-CTGGGATGGAATTGTGAG-3′。PCR反应体系为SYBR MIX 10 μl、上游引物 1 μl、下游引物 1 μl、cDNA 2 μl、ddHO 6 μl。根据2法计算各组相对mRNA的含量。

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5

JC-1染色 接种H9c2细胞于48孔板中，1×10个/孔，待细胞贴壁后按1.2.1进行分组及给药后，按试剂盒说明书进行操作，荧光显微镜下进行拍照，并用Image J软件进行分析。

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容积调节性能力检测 在观察不同渗透压条件下细胞的容积调节性能力(RVD)时，用等渗液(ISO)灌流细胞5 min，改换低渗液灌流20 min，再等渗液灌流5 min。细胞玻片安放在浴槽中，用数字式摄像机连接相差显微镜与计算机，调节好显微镜焦距及亮度后，拍摄图像，采用Image Pro Plus软件进行处理。

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7

全细胞膜片钳记录ICl电流 该实验使用芯片膜片钳技术检测H9C2细胞膜上氯电流的变化。膜片钳技术用于记录电压钳位条件下一小片膜中的电流，将细胞悬浮液置于芯片上。然后，通过气泵施加压力进行抽吸，将单个细胞吸引并定位在孔上。通过向孔施加负压来实现膜的密封和破裂以建立整个电池构造。在NPC系统中，压力由PatchControl软件控制。使用此软件，可以运行预定义的协议，仪器收集的电流信号由EPC 10 USB膜片钳放大器处理后呈现于显示屏并通过程序记录下来。观察并记录等渗条件下的稳定电流5 min，接着将细胞外环境的等渗液换为低渗液，待细胞电流稳定后，持续记录稳定电流5 min，最后将细胞外环境的低渗液换为等渗液，记录全程的电流变化。

2 结果

2.1 siRNA转染H9c2心肌细胞后ClC-3 mRNA及蛋白的表达

图1显示，与空白组比较，siRNA空载对照组并不能影响细胞内ClC-3 mRNA和蛋白水平，而siRNA转染H9c2细胞48 h后，使细胞内ClC-3 mRNA降低(

F

=6.35，

P

<0.05)但并没有引起细胞内ClC-3蛋白水平的变化(

F

=2.77，

P

>0.05)；siRNA ClC-3转染72 h后，能诱导细胞内ClC-3 mRNA和蛋白水平都降低(

F

=52.84，

P

<0.01和

F

=70.93，

P

<0.01)。结果表明，siRNA转染H9c2细胞72 h后可以成功构建ClC-3表达下调模型。

图1 siRNA ClC-3抑制H9c2细胞ClC-3表达

2.2 ClC-3表达下调对H9c2心肌细胞的影响

该研究分别采用α-tubulin(一种细胞骨架蛋白)进行荧光染色和qRT-PCR的方法来观察ClC-3表达下调对H9c2心肌细胞表面积和细胞内几个常见的心肌肥大标志因子ANP、BNP和β-MHC mRNA的表达水平的影响。如图2所示，ISO(10 μmol/L)刺激H9c2细胞48 h后，心肌细胞的表面积增加[ISO组

vs

空白组，(2 130.40 ± 369.78)

vs

(877.33 ± 109.88)，

F

=11.33，

P

<0.01，图2A、B]，且ANP、BNP和β-MHC mRNA的表达水平降低(

F

=9.38、597.9、86.51，均

P

<0.01)；而与siRNA空载对照组不同，siRNA诱导的ClC-3敲低组的细胞表面积增加[ClC-3敲低组

vs

空白组，(2 127.33 ± 109.62)

vs

(877.33 ± 109.88)，

F

=4.93，

P

<0.01]，ANP、BNP和β-MHC mRNA的表达水平升高(

F

=12.8、1 088、63.6，

P

<0.01)。

图2 ClC-3表达下调可使H9c2细胞产生心肌肥大

2.3 ClC-3表达下调对H9c2心肌细胞线粒体功能的影响

JC-1是一种广泛用于检测MMP△Ψm的理想荧光探针，红色荧光代表JC-1聚集体(即MMP较高)，绿色荧光代表JC-1单体(即MMP较低)，绿色荧光与红绿荧光强度的比值越高说明MMP越高；线粒体电子传递链抑制剂CCCP(CON+)被用作阳性对照。如图3所示，与空白组相比，siRNA 空载组不能引起MMP发生变化(

F

=3.26，

P

>0.05)，而与CCCP(CON+)(

F

=64.5，

P

<0.01)和ISO(

F

=30.49，

P

<0.01)处理一样，siRNA ClC-3能使MMP下降(

F

=280.5，

P

<0.01)，说明ClC-3表达下调能诱导线粒体结构和功能损伤。

图3 细胞内线粒体膜电位的变化

2.4 ClC-3表达下调对H9c2心肌细胞容积激活性氯离子电流的影响

与空白组相比，空载siRNA处理后不会引起细胞容积激活性氯电流的改变(

F

=17.25，

P

<0.01)，而ISO诱导与ClC-3表达下调都可抑制细胞容积激活性氯离子电流(

F

=7.72，

P

<0.01)。结果显示，ClC-3可能通过调节容积激活性氯离子电流调控H9c2心肌细胞的表面积大小。见图4。

图4 ClC-3表达下调对H9c2细胞容积激活性氯离子电流的影响

2.5 ClC-3表达下调对H9c2心肌细胞容积调节能力的影响

如图5所示，与空白组相比，ISO诱导H9c2心肌细胞肥大后，H9c2细胞的容积调节性能力下降(

F

=1.49，

P

<0.01)；而空载siRNA不引起细胞容积调节能力的改变(

F

=4.59，

P

>0.05)；siRNA转染敲低ClC-3组与ISO组类似，也可抑制细胞容积调节能力(

F

=2.67，

P

<0.01)。以上结果表明ClC-3表达下调导致H9c2细胞的肥大可能与其下调细胞的容积调节性能力有关。

图5 ClC-3表达下调对H9c2细胞RVD的影响

3 讨论

心肌肥大的特征是长期高血压引起的室壁厚度增加，是心血管疾病的主要危险因素，严重威胁到人类健康。它常会引起心脏收缩功能障碍、心肌间质的纤维化以及胎儿基因ANP、BNP、β-MHC的等效应分子的表达增加。ClC-3氯通道是容积调节性氯离子通道基因家族成员之一，在各类动物体内广泛表达。参与到细胞兴奋、迁移、增殖、分化、凋亡和体积稳态的过程中。研究表明ClC-3在主动脉缩窄术诱导的心肌肥厚及心力衰竭中起着重要作用。因此，ClC-3可能具有调控心肌肥大的作用。该研究在前期研究基础上进一步采用siRNA转染H9c2心肌细胞72 h成功构建了ClC-3表达下调的细胞模型。ClC-3下调的同时能诱导H9c2心肌细胞表面积增加，心肌肥大标志性因子ANP、BNP和β-MHC mRNA的表达水平升高，表明ClC-3表达下调能诱导心肌细胞肥大。这与前期研究在大鼠原代心肌细胞、H9c2细胞和C57小鼠以及AAV-9介导的ClC-3过表达小鼠的结果是一致的。同时该研究还通过与计算机连接的显微镜和膜片钳技术检测了细胞RVD能力和细胞容积激活性氯离子电流。结果显示，ClC-3下调降低细胞的RVD能力和细胞的容积激活性氯离子电流，这些可能与其诱导心肌细胞肥大具有一定关系。

心脏是机体的重要器官，线粒体约占心肌细胞质量的30%，心脏空白运转所需的能量约95%来自线粒体。因此，线粒体功能与心脏功能息息相关，线粒体在细胞内信号传导、细胞死亡等方面发挥着重要作用。有报道显示，由于线粒体功能受损导致的能量生成障碍将导致心脏代谢疾病。有研究表明，肥大性心肌病中也观察到心脏线粒体肿胀、嵴断裂、呼吸链复合物活性降低。MMP作为重要的生物能量指标，能够反映线粒体的功能。该研究表明这与ISO处理相似，ClC-3下调也能诱导MMP降低，而导致线粒体功能损伤，这可能也与其能诱导心肌细胞肥大有关。