褪黑素延缓糖尿病大鼠肾脏细胞衰老的机制研究

陈永昕，刘婉卿，周 青，汪 渊，王 怡，朱华庆

糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)的发病机制和原因较为复杂，其特征是血流动力学和代谢因素的相互作用，包括高血糖水平、晚期糖基化终产物(advanced glycation end-products，AGEs)和肾素-血管紧张素-醛固酮系统(rein-angiotensin-aldosterone-system，RAAS)的激活，是慢性肾病(chronic kidney disease，CKD)的主要病因。在DN晚期，肾功能丧失则会引发终末期肾病(end stage renal disease，ESRD)，ESRD的高病死率，高致残率给人类健康带来巨大威胁。研究表明，受损的肾脏细胞自噬水平下降，增强自噬可以有效维持细胞内的稳定状态，抑制肾脏纤维化。同时，DN也与肾脏组织细胞G1期停滞及衰老密切相关，而p16、p53、p21作为细胞衰老的标志物，它们均是调控细胞周期的关键基因，参与细胞衰老的表达调节；另有文献显示，激活MLCK/pMLC信号通路能够调节氧化应激效应，促进ROS生成，引发细胞衰老。自噬与衰老都是细胞应激的反应，二者密切相关，机体衰老常伴随着自噬水平的降低，增强自噬可以延缓衰老的发生。

褪黑素(melatonin，MLT)是由哺乳动物分泌的一种胺类激素，它可以通过直接清除自由基来实现抗氧化活性和抗炎性。同时有研究表明，MLT能增强自噬，也具有很强的抗衰老作用。该实验以DN大鼠为对象，探究在MLT参与下肾脏细胞自噬与衰老的变化，深化MLT对肾脏抗衰老作用的认识。

1 材料与方法

1.1 实验动物

清洁级SD雄性大鼠15只，体质量250～300 g，购自安徽医科大学实验动物中心，12 h光照、12 h黑暗交替，温度(22±1)℃，湿度在50%～60%条件下适应性喂养。

1.2 主要试剂

链脲佐菌素(streptozotocin，STZ)、MLT均购自美国Sigma公司；尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)测试盒、肌酐(CRE)测定试剂盒、Masson染液均购自南京建成生物工程研究所；Western blot检测试剂：一抗MLCK、Anti-p62抗体均购自美国Santa Cruz公司；Anti-beta Actin、Anti-p21、Anti-p16、Anti-p53、山羊抗兔IgG-HRP、山羊抗小鼠IgG-HRP均购自英国Abcam公司；LC3B购自美国CST公司；BCA试剂盒、细胞衰老β-半乳糖苷酶染色试剂盒均购自上海碧云天生物技术公司。

1.3 主要仪器

-80 ℃超低温冰箱(日本SANYO电器股份有限公司)；酶标仪(美国Thermo Fisher Scientific公司)；全自动数码凝胶成像系统(上海欧翔公司)；磁力搅拌器(北京中兴伟业仪器有限公司)；pH仪(上海雷磁仪器厂)；冰冻切片机(德国Leica公司)；正置生物显微镜(德国Leica公司)。

1.4 方法

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造模方法及实验分组 SD大鼠经适应性喂养后，随机分为正常组、模型组和MLT组，各5只。模型组和MLT组一次性腹腔内注射剂量为55 mg/kg 的STZ，正常组注射等体积的枸橼酸缓冲液。48 h后空腹尾静脉取血，测得血糖≥16.7 mmol/L，造模成功。MLT组腹腔注射MLT 10 mg/(kg·d)，正常组和模型组腹腔注射等体积生理盐水，共饲养16周。

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2

标本采集及处理 首先称取SD大鼠体质量，采用乙醚麻醉后固定在实验板上，找到主动脉，取主动脉血注入装有肝素的抗凝管，静置2 h后，3 000 r/min离心10 min，取血清后做好标记并置于-20 ℃冰箱待测。用剪刀剪开大鼠腹部，找到肾脏组织，剪刀剪下，置于预冷的PBS缓冲溶液中漂洗3次，洗去血和残余结缔组织，滤纸除去残余水分，一部分经液氮急速冷冻，另一部分采用最佳切削温度化合物(optimal cutting temperature compound，OCT)包埋剂冰冻包埋后切片，每片厚度为5 μm，均储存于-80 ℃冰箱中备用。

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血肌酐和BUN 取标记好的血清，检测各组血肌酐(serum creatinine，SCR)和BUN水平。SCR：在96孔板上，每孔分别加入6 μl样本、180 μl酶溶液A，37 ℃下孵育5 min，于546 nm波长测定吸光度值A1，再加入60 μl酶溶液B，再次测定吸光度值A2，根据说明书公式计算肌酐值；BUN：按说明书配置好各试剂，取20 μl待测样本加入250 μl缓冲酶液中，混匀后37 ℃准确水浴10 min，然后加入酚显色剂和碱性次氯酸钠各1 ml，充分混匀后37 ℃水浴10 min，640 nm波长下测定吸光度值，根据公式计算BUN含量。

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Masson染色观察 从-80 ℃冰箱取肾组织冰冻切片，按常规方法进行Masson染色，光镜下观察肾组织病理学变化。

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β

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半乳糖苷酶(SA

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β

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gal)染色 取肾组织冰冻切片，按说明书步骤进行SA-β-gal染色，光镜下观察蓝色沉淀。

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Western blot检测法 取保存于冰箱中的肾脏组织，称取0.1 g，PBS漂洗后，用滤纸除去残余水分，用剪刀剪碎后转入研磨器中，加入1 ml蛋白裂解液(含PMSF，1∶1 000)，置于冰上充分研磨至匀浆，再转至EP管中，反复冻融3次，4 ℃离心机14 000 r/min离心30 min后取上清液。采用BCA法测定蛋白浓度后，加蛋白裂解液调配成等体积同浓度的样本，再加入蛋白上样缓冲液，混匀后于沸水中煮10 min至变性，-80 ℃保存。配置SDS-PAGE凝胶，各组样本等量上样进行电泳，电泳完成后将蛋白转至PVDF膜上，转膜完成后置于摇床上，以5%脱脂牛奶室温封闭2 h。一抗p21(1∶1 000)、p16(1∶1 000)、p53(1∶1 000)、β-actin(1∶1 000)、4 ℃ 孵育过夜，TBST缓冲液洗膜后二抗(1∶5 000)室温下孵育2 h。TBST洗膜，配置显影剂进行显影。以QuantityOne软件分析各条带灰度值，参照β-actin计算相对灰度值。

2 结果

2.1 MLT干预后对DN大鼠肾脏组织SCR、BUN水平的影响

模型组大鼠与正常组比较，BUN、SCR水平均有增高(

P

<0.05)；MLT治疗后，与模型组比较，MLT组BUN、SCR水平均有下降(

P

<0.05)。见表1。

表1 MLT对DN大鼠BUN及SCR水平影响

2.2 Masson染色结果

与正常组比较，模型组DN大鼠肾间质纤维化明显；经MLT治疗后，胶原纤维染色阳性率显著下降。见图1。

图1 各组大鼠肾组织Masson染色 ×200

2.3 SA-β-gal染色结果

与正常组比较，模型组DN大鼠肾组织细胞出现明显的SA-β-gal染色阳性；与模型组比较，MLT组SA-β-gal染色阳性率显著下降。见图2。

图2 各组大鼠肾组织SA-β-gal染色 ×200

2.4 MLT干预后对DN大鼠肾脏组织p62、LC3B蛋白表达水平的影响

与正常组比较，模型组大鼠肾脏组织中p62蛋白水平升高(

P

<0.05)，LC3B蛋白水平降低(

P

<0.05)；MLT治疗后，DN大鼠肾脏组织中p62蛋白表达水平下降(

P

<0.05)，LC3B蛋白表达水平升高(

P

<0.05)。见图3。

图3 Western blot检测肾脏组织中p62、LC3B表达情况

2.5 MLT干预后对DN大鼠肾脏组织MLCK表达水平的影响

与正常组比较，模型组大鼠肾脏组织中MLCK蛋白表达水平升高(

P

<0.05)；MLT治疗后，DN大鼠肾脏组织的MLCK表达水平下降(

P

<0.05)。见图4。

图4 Western blot检测肾脏组织中MLCK表达情况

2.6 MLT干预后对DN大鼠肾脏组织p16、p52、p21表达水平的影响

与正常组比较，模型组大鼠肾脏组织中p16、p52、p21蛋白表达水平均有升高(

P

<0.05)；MLT治疗后，DN大鼠肾脏组织中p16、p52、p21蛋白表达水平均有下降(

P

<0.05)。见图5。

图5 Western blot检测肾脏组织中p16、p53、p21表达情况

3 讨论

DN是造成CKD和ESRD的主要原因之一，针对糖尿病患者的既定治疗方案包括控制血糖、胆固醇和高血压等，但这些方案对ESRD及其带来的心血管风险并不能提供完全的保护。因此，研究DN发病机制并寻找新的更有效的治疗方法具有重要意义。DN是典型的细胞衰老相关性疾病，在其发展过程中涉及的机制都与衰老密切相关。研究细胞衰老在DN中的新兴作用，靶向延缓或阻断衰老的治疗方法也被认为是治疗DN的一种很有前景的新策略。

衰老和自噬都是细胞对外界刺激因素的应激反应，活性氧刺激、炎症等都会引发细胞衰老、激活自噬。细胞衰老往往伴随自噬水平的降低，恢复自噬可以延缓衰老的进展。自噬是胞内依赖溶酶体途径清除、降解未折叠或折叠错误蛋白质及受损细胞器的过程，对维持细胞自身稳态、延续细胞生命至关重要。在溶酶体降解过程中，p62与底物结合后被蛋白水解酶降解，LC3B则参与自噬小体的形成，通过自噬标记物p62和LC3B可以直接反应自噬水平的变化。细胞衰老最明显的特征是细胞分裂进入不可逆的细胞周期阻滞状态。p53-p21-RB信号通路和p16INK-RB信号通路主要负责调控细胞周期，激活这2条通路会导致p53蛋白、p21蛋白、p16蛋白高表达，进而加速细胞衰老的进程。研究表明，p53上调会加重自噬抑制，肾纤维化与p53呈正相关，与LC3B呈负相关。p21则是p53的下游基因，其编码的蛋白可以通过C端与增殖细胞核抗原(PCNA)结合，使PCNA无法活化DNA聚合酶，进而抑制DNA的合成；另一方面p21蛋白还可以使视网膜母细胞瘤(RB)无法磷酸化，阻断RB-E2F信号通路，无法激活细胞分裂转录因子，从而阻滞细胞G1期，使肾脏细胞向衰老样表型发展，同时抑制肾小管细胞的增殖。p16则通过结合和抑制细胞周期素依赖激酶4和6(CDK4/6)来阻止细胞增殖，诱导细胞衰老，而p16的降解和定位依赖于自噬途径。

MAPK(丝裂原活化蛋白激酶)信号通路调节包括应激、炎症在内的诸多病理效应，其中一条重要支路为细胞外信号调节激酶(ERK)，研究表明，ERK活化可以促使肌球蛋白轻链(MLC)在肌球蛋白轻链激酶(myosin light chain kinase，MLCK)的介导下磷酸化，带来一系列连锁反应，抑制MLCK可以显著降低细胞从静止状态向增殖状态转变，作为负细胞调节因子的p16在转变过程中核表达水平也出现显著变化。近年来，有实验表明，NADPH氧化酶(NOX)衍生的ROS能促进高脂血症中循环内皮祖细胞(EPC)的衰老和功能障碍，其中NOX的上调和ROS的增加则依赖于MLCK信号通路的磷酸化，另有研究称AGEs也通过相关途径参与调节内皮细胞衰老。

MLT是一种有较强的生物活性的内源性激素，参与生理和神经内分泌功能的昼夜节律调节，相比于化学合成药物，对机体的副作用小，能维持细胞膜的稳定,具有增强自噬、抗氧化、抗炎症、抗衰老等诸多功能。在成功构建大鼠DN模型并给予MLT干预后，该实验检测了DN大鼠血清中BUN、SCR的含量，与模型组比较，MLT组的BUN和SCR水平均有下降，表明肾功能在MLT治疗后得到了改善；随后采用Masson染色观察了肾组织的病理变化，结果显示，MLT有效地减缓了肾损伤。MLT能诱导细胞增强自噬，为了研究MLT是否通过诱导自噬保护了肾脏细胞，该研究对自噬标志物p62、LC3B进行了测定。数据表明，模型组中自噬相关蛋白LC3B表达水平降低，p62水平升高，自噬受到抑制。经MLT治疗后，LC3B表达水平升高，p62表达水平降低，自噬异常得到改善。该研究又采用了β-半乳糖苷酶(衰老标志物之一)染色法检测了肾脏细胞，结果表明MLT组细胞衰老情况有明显的改善。既往实验表明，MLT在动脉粥样硬化等心血管疾病中能通过p38/MAPK信号通路下调MLCK表达保护心肌细胞；在骨质疏松症中，能通过降低p16表达延缓衰老。该实验采用Western blot法检测了MLCK和p16，结果显示MLT组MLCK、p16较模型组有所下降。MLT可能通过抗衰老保护了DN大鼠肾脏组织，该实验又进一步检测了肾脏组织中的细胞衰老标志物p53和p21。与正常组比较，模型组中p53、p21表达水平均有升高；经MLT治疗后，p53、p21表达水平显著下降。因此，推测MLT在肾脏组织中可能通过增强自噬、延缓衰老保护DN肾脏。然而，自噬与DN发病机制的关系仍然需要探究，p53、p21、p16也受多种信号因子调控，未来有必要进一步研究MLT在保护肾脏细胞过程中的具体作用，这对治疗DN寻找可能的靶点有着重要的意义。