养心定悸胶囊在缺血再灌注损伤心肌组织中的保护作用研究

王 静，贾凌梅，刘 畅，栾莹莹，贾 敏

(1.河北省石家庄市人民医院，河北 石家庄 050027 2.河北医科大学第二医院心内科，河北 石家庄 050000)

心肌缺血再灌注损伤是临床经皮冠状动脉介入治疗等治疗动脉粥样硬化，心肌梗死等疾病中的常发的并发症，严重的心肌缺血再灌注损伤可以二次导致心肌冠状动脉血供不足和多种临床心血管并发症[1，2]。缺血/再灌注(I/R)可导致血管功能、代谢和结构异常的发生。大量的证据表明细胞溶质钙超载和氧化应激反应在缺血/再灌注心肌缺血损伤中扮演重要作用[3]。内源性活性氧参与调节细胞内和细胞内的生物过程，正常条件下机体的抗氧化系统可以平衡体内的氧化应激状态，但在异常条件下，机体的抗氧化机制破坏，过度释放的氧自由基，氮自由基可诱导组织损伤发生，导致线粒体的钙超载。氮代谢异常导致的氮自由基过量是机体氧化应激反应的中除了氧自由基外的另一种重要因子可导致细胞线粒体蛋白的修饰，导致机体氧化应激反应显著并引起线粒体的电势的改变，最终引起线粒体损伤的发生[4]。因此改善氮自由基过量以及由其导致的氧化应激反应及线粒体损伤在心肌缺血再灌注损伤中具有重要作用。养心定悸胶囊，由地黄、麦冬、红参、大枣、阿胶、黑芝麻、桂枝、生姜、炙甘草组成。具有养血益气，复脉定悸的功效。用于气虚血少，心悸气短，心律不齐，盗汗失眠，咽干舌燥，大便干结[5]。该药临床对于快速性和缓慢性心律失常均有良好的治疗效果，其能够双向调节心律，提高心功能，改善心率变异性和血管内皮功能。且改善心慌、气短、乏力、失眠等症状。前期的研究发现养心定悸胶囊在改善心肌缺血再灌注损伤诱发的心率失常中具有一定作用，同时对心肌缺血再灌注损伤的发生具有一定保护作用[6]。氮自由基氮代谢异常是导致心肌氧化应激反应的关键因素之一，而养心定悸胶囊具有改善氧化应激的作用，但其对心肌缺血再灌注发生时对机体氧化应激反应的影响作用还有待阐明。因此本研究将建立心肌缺血再灌注模型，考察养心定悸胶囊在心肌缺血再灌注损伤中对机体氧化应激反应及心肌氮代谢的影响及调控机制。

1 材料及方法

1.1试剂及仪器:养心定悸胶囊购自石药集团，SOD，GSH-px，MDA(南京建成生物工程公司)；线粒体提取试剂盒(江苏碧云天生物技术研究所，中国)；异柠檬酸脱氢酶(ICDH)、琥珀酸脱氢酶(SDH)、苹果酸脱氢酶(MDH)，α-酮戊二酸脱氢酶(α-KGDH)ELISA试剂盒(sigma，美国)；鸟氨酸脱羧酶(ODC)和亚精胺/精胺N-乙酰转移酶(SSAT)ELISA试剂盒(sigma，美国)。Mpre200酶标仪(Tecan公司，瑞士)。

1.2实验动物及模型建立:采用Langendorff离体心脏灌流建立大鼠缺血再灌流损伤模型，大鼠腹腔注射肝素1000U/kg抗凝后，戊巴比妥钠麻醉。迅速取出心脏，清洗残留血液后心脏悬挂于Langendorff灌流装置上，逆行恒压灌注。剪开右心房，冠脉流出液自然流出。恒温(37℃)、恒压(100cm H2O)条件下采用95%O2+5%CO2混合气饱和的K-H缓冲液(pH值7.35～7.40)灌注。剪开左心耳，将连接有测压导管的心室球囊送入左心室，另一端连接多导生理记录仪。灌注液及心脏周围温度用恒温循环水浴维持在37℃±0.5℃。平衡灌注30min，待心脏各项功能稳定，关闭灌流液停止灌流，造成全心缺血，30min后打开灌流液再复灌30min。将30只大鼠分为正常对照组、模型组、停灌前给药低、中、高剂量干预组、，每组6只。将养心定悸胶囊溶于灌流液中，采用0.45μm微孔滤膜过滤，使终浓度分别为0.05g/L、0.2g/L、0.5g/L。给药剂量参照临床用量分别设置高、中、低剂量并按照体表面积折算。正常对照组用正常灌流液灌注。模型组用正常灌流液灌注，平衡30min后，停止灌注30min，复灌30min。停灌前给药组：正常灌流平衡20min后，分别用含有不同剂量的含药灌流液灌注10min后，停止灌注30min，复灌30min。

1.3乳酸脱氢酶及肌酸激酶同工酶活性分析:心肌细胞损伤通过测量冠状动脉内乳酸脱氢酶(LDH)和肌酸激酶同工酶(CK-MB)活性，采用商业试剂盒，按照试剂盒说明书，取200μg冠状动脉，加入PBS匀浆后检测(Agappediagnostics，印度)。

1.4抗氧化酶及脂质过氧化产物含量检测:取心肌组织100mg检测心脏抗氧化酶测定和脂质过氧化含量及活性，测定采用分光光度计检测。超氧化物歧化酶测定SOD、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)采用试剂盒说明书方法检测。总蛋白采用Lowry等人的方法进行分析。水平硫代巴比妥酸反应物(TBARS)和脂质过氧化物(LOOH)按照说明书检测。

1.5多胺含量测定:心肌组织中腐胺、精胺、多胺含量采用高效液相色谱法(LC-6A，岛津，高效液相色谱法(LC-6A，岛津，日本)。心脏样本用0.3M冰冷高氯酸，苯甲酰氯进行衍生化，苯甲酰氯衍生物用氯仿萃取。衍生物用超高密度ODS C18柱(250mm×4.6mm，5μm，水，美国)分离。柱洗脱液用紫外检测器在229nm监测(安捷伦1200，安捷伦公司)。

1.6鸟氨酸脱羧酶(ODC)和亚精胺/精胺N-乙酰转移酶(SSAT)活性检测:心肌组织在4℃下匀浆的等分，以30000×g离心20min分别测定ODC和SSAT活性。ODC活性通过测定37℃下0.5μCi的L-[1-14C]鸟氨酸释放的14CO2量来测量。混合物在37℃下培养60min。通过添加0.8mL 1mM柠檬酸，继续培养20min。ODC活性以pmol/mg蛋白质表示。将86μl匀浆液添加到含有100mM的反应混合物中Tris-HCl(pH7.8)，3mM亚精胺(pH7.0)，1mM二硫苏糖醇。然后将该混合物在37℃下培养10min。通过添加20μM盐酸羟胺进行测定，以22000×g离心5min后检测。

1.7NO及ONOO-含量检测:组织用二氢乙胺(DHE，Cat)孵育。37min并小心地清洗冷PBS两次以去除多余的DHE。用研钵和杵将碎片粉碎液氮。用抹刀将粉末转移到试管中，加入乙腈。组织样本离心后，上清液在室温下转移并在真空浓缩器中干燥。沉淀层在含有0.1%Triton X-100的溶解缓冲液(Dulbecco's PBS，pH值)中溶解，用BCA蛋白试剂盒(Cat。P0012号，碧云天生物科技，上海，中国)。初始流动相(60μ五十)在涡流前加入干燥样品注入10μL放入带有荧光检测器的高效液相色谱仪。条件是：λ发射=580nm和λ激发=480nm，柱温25℃带进样量20μL。流动相为90% H2O～10%CH3CN(0.1%三氟乙酸)，流速为1.0mL/min。HPLC柱为Agilent 5 TC-C18。

1.8线粒体相关代谢酶活性检测:异柠檬酸脱氢酶(ICDH)、琥珀酸脱氢酶(SDH)、苹果酸脱氢酶(MDH)，α-酮戊二酸脱氢酶(α-KGDH)按照试剂盒检测说明检测。取模型鼠心肌组织100mg，匀浆后，采用梯度离心法分离模型鼠线粒体分离，检测心肌组织相关酶活性。

1.9统计分析:数值表述为均值±标准差,使用SPSS11.5版对数据进行统计分析，采用单因素方差分析法进行统计分析，P<0.05为具有统计学差异。

2 结 果

2.1养心定悸胶囊对缺血再灌注心肌组织中LDH，CK-MB水平的影响:缺血再灌注可以引起心肌组织损伤的发生，LDH、CK-MB是考察心肌组织损伤的经典标志物，实验结果表明模型组LDH、CK-MB水平与对照组具有显著差异(P<0.05)，显著升高，而给与养心定悸胶囊干预的心肌组织中LDH，CK-MB活性有下降趋势，中、高剂量养心定悸胶囊可以显降低心肌组织中的LDH，与模型组均具有显著性差异(P<0.05)，同时中，高剂量组养心定悸胶囊干预后CK-MB活性与模型组具有统计学差异(P<0.05)。见表1。

表1 养心定悸胶囊对缺血再灌注心肌组织LDH CK-MB水平的影响

2.2养心定悸胶囊对缺血再灌注心肌组织中抗氧化酶及脂质过氧化产物水平的影响:缺血再灌注可以引起心肌组织损伤的发生，氧化应激反应是心肌组织损伤的显著诱因，实验结果表明模型组抗氧化酶SOD、CAT、GPx水平与对照组具有显著差异(P<0.05)，显著降低，而给与养心定悸胶囊干预的心肌组织中SOD、CAT、GPx活性明显改善，高剂量养心定悸胶囊可以显降低心肌组织中的CAT、GPx水平，与模型组均具有显著性差异(P<0.05)，同时中，高剂量组养心定悸胶囊干预后SOD活性与模型组具有统计学差异(P<0.05)。此外模型组脂质过氧化产物TBARS、LOOH含量显著升高，而养心定悸胶囊干预后模型鼠组织中脂质过氧化产物水平显著降低与模型鼠具有统计学差异(P<0.05)。见表2。

表2 养心定悸胶囊对缺血再灌注心肌组织中抗氧化酶及脂质过氧化产物水平的影响

2.3养心定悸胶囊对缺血再灌注心肌组织中多鸟氨酸脱羧酶(ODC)和亚精胺/精胺N-乙酰转移酶(SSAT)活性水平的影响:缺血再灌注可以导致心肌组织ODC和SSAT活性水平显著升高，实验结果表明模型组ODC和SSAT水平与对照组具有显著差异(P<0.05)，而给与养心定悸胶囊干预的心肌组织中ODC和SSAT活性呈下降趋势，高剂量养心定悸胶囊可以显降低心肌组织中的ODC，与模型组，低剂量组均具有显著性差异(P<0.05)，同时中，高剂量组养心定悸胶囊干预后SSAT活性与模型组，低剂量干预组均具有统计学差异(P<0.05)。见表3。

表3 养心定悸胶囊对缺血再灌注心肌组织中多鸟氨酸脱羧酶和亚精胺/精胺N-乙酰转移酶活性水平的影响

2.4养心定悸胶囊对缺血再灌注心肌组织中多胺，NO及ONOO-水平的影响：多胺类物质是考察心肌组织损伤的经典标志物，实验结果表明模型组腐胺，精胺，多胺水平与对照组具有显著差异(P<0.05)，显著升高，而给与养心定悸胶囊干预的心肌组织中腐胺，精胺，多胺含量均显著下降趋势。中、高剂量养心定悸胶囊可以显降低心肌组织中的精胺、多胺，与模型组均具有显著性差异(P<0.05)，同时高剂量组养心定悸胶囊干预后腐胺含量与模型组具有统计学差异(P<0.05)。NO及ONOO-含量与胺含量相关，实验结果表明，模型组NO水平显著降低，ONOO-含量明显升高，而给与养心定悸胶囊干预后，组织中NO水平显著升高，且可抑制ONOO-含量的升高，中高剂量养心定悸胶囊干预均有显著作用(P<0.05)。见表4。

表4 养心定悸胶囊对缺血再灌注心肌组织中多胺及NO及ONOO-含量水平的影响

2.5养心定悸胶囊对缺血再灌注心肌组织中线粒体相关代谢酶活性水平的影响:缺血再灌注可以引起心肌组织能量供应障碍，线粒体TCA循环功能障碍的发生，实验结果表明模型组线粒体关键物质代谢酶ICDH、SDH、MDH、α-KGDH均显著降低水平与对照组具有显著差异(P<0.05)，而给与养心定悸胶囊干预后，检测心肌组织中ICDH、SDH、MDH、α-KGDH，结果表明，养心定悸胶囊对线粒体TCA循环关键代谢酶活性具有一定的改善作用，中、高剂量养心定悸胶囊可以显升高心肌组织中的ICDH、MDH、α-KGDH活性，与模型组均具有显著性差异(P<0.05)，同时高剂量组养心定悸胶囊干预后SDH活性与模型组具有统计学差异(P<0.05)。见表5。

表5 养心定悸胶囊对缺血再灌注心肌组织中线粒体相关代谢酶活性水平的影响

3 讨 论

心肌缺血可导致线粒体ATP的消耗，而再灌注导致活性氧中间体和钙的生产超载，细胞代谢和生成的毒性分子导致心肌缺血/再灌注损伤的发生。心肌组织中氧，氮自由基的产生和钙超载是心肌缺血/再灌注损伤发生发展的两个主要原因，是与其疾病发展有关的重要病理生理学事件[7]。本研究中发现缺血再灌注心肌组织损伤性标志物，LDH、CK-MB水平明显升高，缺血再灌注心肌组织中氧化应激产物TBARS、LOOH含量明显升高与正常组具有统计学差异，心肌组织抗氧化酶GPx、SOD、CAT活性显著降低与正常组具有统计学差异。

多胺(精胺、亚精胺和腐胺)是所有真核细胞的固有成分，是机体含氮的主要内源性物质。它们在细胞程序性死亡、细胞生长和分化、线粒体膜通透性转变和胞浆钙稳态中起着重要作用[8]。多胺可参与组织缺血损伤中，如脑缺血、肾脏缺血等缺血/再灌注损伤。鸟氨酸脱羧酶(ODC)和亚精胺/精胺N1乙酰转移酶(SSAT)分别是多胺生物合成和降解的关键酶。ODC将鸟氨酸转化为腐胺，腐胺被代谢为精胺和亚精胺。SSAT乙酰化精胺和亚精胺形成乙酰化多胺。乙酰化多胺被多胺氧化酶(PAO)转化为腐胺，在这个过程中，过氧化氢(H2O2)和氨基丙醛大量生成[9]。研究表明心肌缺血/再灌注损伤大鼠，多胺合成和降解中的关键酶ODC和SSAT活性水平显著升高。导致心肌组织含氮的多胺类物质代谢异常，继而引起心肌氮自由基含量升高，诱发氧化应激反应，导致线粒损伤发生，此外一氧化氮(NO)是调控机体血管功能的关键内源性物质。其也可与超氧物反应可生成过氧亚硝酸盐阴离子(ONOO-)，而ONOO-可导致心肌缺血/再灌注损伤的发生，损伤血管等组织。研究发现多胺与和NO通路相互影响。有研究表明NO通过抑制ODC活性在改善动脉粥样硬化[10]。而多胺的大量产生可导致NO氧化为ONOO-加剧血管损伤的发生[11]。

本研究发现，缺血再灌注大鼠模型中，心肌组织氧化应激反应明显加剧ODC和SSAT活性水平，促进机体多胺的产生，而养心定悸胶囊可明显改善其作用，降低机体多胺类物质的产生，同时减少机体ONOO-含量，恢复NO含量，改善血管功能。线粒体能量代谢的改变是心肌损伤的关键因素。氮代谢异常可导致线粒体损伤的发生，而本研究中发现缺血再灌注可以导致心肌心肌组织中线粒体相关代谢酶活性水平的显著减低，线粒体关键物质代谢酶ICDH、SDH、MDH、α-KGDH均显著降低。而养心定悸胶囊在中，高剂量组干预后，大鼠心肌组织中线粒体能量代谢能力显著改善。柠檬酸盐脱氢酶(ICDH)、琥珀酸脱氢酶(SDH)、苹果酸脱氢酶(MDH)、α-酮戊二酸脱氢酶(α-KGDH)是参与线粒体TCA循环产生ATP的关键活性酶。而养心定悸胶囊可显著改善其活性，因此有助于线粒体的能量生成。养心定悸胶囊，由地黄、麦冬、红参、大枣、阿胶、黑芝麻、桂枝、生姜、炙甘草组成，其中研究表明大枣能明显阻断N二甲基亚硝胺的形成，不同配比的芍药炙甘草可以改变机体NO含量[12]，以上药材可能参与机体氮代谢的影响，但是目前针对其主要药材及其活性成分对心肌缺血再灌注损伤机体氮代谢调控的研究尚未报道。

本研究表明养心定悸胶囊可显著改善缺血再灌注损伤心肌组织氮代谢异常，减少心肌组织胺类物质含量，减少氮自由基，恢复心肌组织线粒体能量代谢，但是养心定悸胶囊参与调控ODC和SSAT活性的分子机制还有待阐明。本研究对于将养心定悸胶囊用于动脉粥样硬化治疗提供了一定的前期基础，但其后期还有待进一步开展相关临床研究。