免疫佐剂MF59稳定性的优化及其局部免疫调节效果比较

凤羽龄，郭 伟，湛孝东，周萍萍，姜玉新，唐小牛

(1.皖南医学院 基础医学院，安徽 芜湖 241002；2.嘉兴学院 医学院，浙江 嘉兴 314001)

MF59是一种由角鲨烯、司盘85、Tween 80和柠檬酸缓冲液按一定比例乳化而成的水包油乳化剂，颗粒直径约为160 nm，安全无毒且可完全降解[1]，是目前欧盟批准用于人体的佐剂，已广泛应用于流感、乙肝、结核病、疱疹病毒疫苗及肿瘤疫苗的制备[2]。

与传统佐剂(如氢氧化铝等)相比，MF59偏向于更加温和的方式增强免疫应答[3]，即Th1/Th2免疫应答的相对平衡。研究表明，单独应用MF59为佐剂可诱导Th2方向偏移的免疫应答[4-5]，但和Toll样受体激动剂(如CpG)配伍使用，可诱导Th1方向偏移的免疫应答[6]，单独应用MF59佐剂，也可诱导Th1方向偏移的免疫应答[7-8]，相同的佐剂为何会产生不同的免疫应答类型，影响免疫应答类型的主要因素是什么，有关此类问题的研究鲜有报道。本研究发现，不同匀浆速度下制备出的MF59的物理性状及其局部免疫调节效果均存在差异，现将结果报道如下，旨在为提高MF59的免疫学应用效果提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 实验动物 雌性BALB/c小鼠，7周龄，购于扬州大学比较医学中心。

1.2 材料 IgE、IFN-γ、IL-4 ELISA试剂盒购于Cloud-clone公司；角鲨烯、司盘85、Tween 80、卵清蛋白(OVA)和台盼蓝均购于SIGMA公司；其他试剂均为国产分析纯。XHF-D型高速匀浆机及JY92-ⅡDN型超声乳化仪购自宁波新芝生物有限公司，ELx800型酶标仪购自美国伯爵公司，22R型台式高速冷冻离心机购自美国Beckman Coulter公司。

1.3 佐剂MF59的制备 按如下体积比配制MF59：角鲨烯(4.3%)、司盘85(0.5%)、Tween 80(0.5%)、10 nmol/L柠檬酸缓冲液(94.7%)，并均分为6份。分别经不同转速的高速匀浆机(5 000 r/min、10 000 r/min、15 000 r/min、20 000 r/min、25 000 r/min)搅拌30 min及超声乳化(2 000W功率，5s工作，5s间隔)30 min；上述操作均在无菌、冰浴中进行。操作完成后离心(6 000 r/min，5 min)，置显微镜下观察，Motic图像分析软件拍照并测量MF59颗粒大小，之后静置于4℃冰箱，观察其稳定性。

1.4 注射液的配制 检测MF59佐剂对抗体及细胞因子影响使用的注射液：MF59乳化剂与100 μg/mL的卵清蛋白水溶液按1∶1体积比进行混合；检测巨噬细胞募集情况使用的注射液：上述注射液中加入台盼蓝，充分混匀，配成台盼蓝浓度为0.04 g/mL的混合液。

1.5 注射部位IgE抗体、IFN-γ、IL-4含量检测 60只小鼠随机分成6组(n=10)，即5 000 r/min组、10 000 r/min组、15 000 r/min组、20 000 r/min组、25 000 r/min组和超声乳化组；将各MF59分别在相应组小鼠左、右后肢腹股沟行皮下免疫，每鼠200μL；注射后第3天处死小鼠并取注射部位皮肤及肌肉组织，清洗去血，匀浆后7 000 r/min离心5min，取上清，ELISA法检测注射部位附近皮肤及肌肉组织总IgE抗体、IFN-γ及IL-4含量，操作按试剂盒说明书步骤进行。

1.6 注射部位巨噬细胞招募 30只小鼠随机分成6组(n=5)，将各MF59分别注射相应组小鼠右后肢，皮下免疫(含10 μg OVA和0.4%的台盼蓝)，每鼠100 μL；同时设PBS组(n=5)，同样的注射方式和部位，用100μL PBS代替，注射后第3天取注射部位皮肤及肌肉组织，参考相关文献[9]，制备组织切片，观察巨噬细胞局部募集情况，并在各组织层次中随机挑选5张切片，每张切片随机选取2个视野，计数并比较各组之间的差异。

2 结果

2.1 不同条件下制备的MF59物理学性状稳定性 经不同转速的高速匀浆机处理后的MF59，离心均未出现分层现象；显微镜下观察见不同转速(5 000、10 000、15 000、20 000、25 000 r/min)匀浆及超声乳化制备的MF59颗粒的直径分别为：<16.5、<10.2、<5.6、<1.3、<0.5和<0.38 μm；经高速匀浆机处理后的MF59颗粒均匀度以25 000 r/min组为最佳，但略差于超声乳化(图1)；静置24 h后各组MF59外观无改变，静置30 d后，5 000 r/min和10 000 r/min条件下制备的MF59的底层出现明显的澄清现象，但未出现分层，其他条件下制备的MF59的外观无明显改变(图1)。

1～6分别为超声乳化、5 000 r/min、10 000 r/min、15 000 r/min、20 000 r/min、25 000 r/min条件下制备的MF59。

2.2 不同匀浆速度条件下制备MF59对注射部位IgE、IFN-γ、IL-4水平的影响 结果显示，超声乳化组及25 000 r/min组IgE抗体水平表达均高于5 000～20 000 r/min组(P<0.05)，20 000 r/min组IgE抗体水平表达均高于5 000～15 000 r/min组(P<0.05)，其他组间IgE抗体水平表达差异均无统计学意义(P>0.05)。10 000 r/min组IFN-γ水平表达均高于超声乳化组、5 000 r/min组、15 000～25 000 r/min组(P<0.05)，5 000 r/min组及15 000 r/min组IFN-γ水平表达均高于超声乳化组、20 000 r/min组及25 000 r/min组(P<0.05)，其他组间IFN-γ水平表达差异均无统计学意义(P>0.05)。超声乳化组IL-4水平表达均高于5 000～25 000 r/min组(P<0.05)，25 000 r/min组IL-4水平表达均高于5 000～20 000 r/min组(P<0.05)，20 000 r/min组IL-4水平表达均高于5 000～15 000 r/min组(P<0.05)，15 000 r/min组IL-4水平表达高于10 000 r/min组(P<0.05)，其他组间IL-4水平表达差异均无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 不同条件下制备MF59对注射部位IgE、IFN-γ、IL-4水平的影响

2.3 不同匀浆速度条件下制备的MF59对注射部位巨噬细胞募集的影响 病理切片观察结果显示，PBS组、5 000 r/min组及10 000 r/min组的皮肤、皮下及肌肉组织中均未观察到巨噬细胞。15 000、20 000、25 000 r/min组和超声乳化组仅在皮下组织切片中观察到巨噬细胞，而皮肤及肌肉组织切片中未观察到(见图2)。其中单个视野中的巨噬细胞数量25 000 r/min组[(7.20±2.53)个/视野]高于20 000 r/min组[(4.00±1.76)个/视野]及15 000 r/min组[(1.50±1.08)个/视野](P<0.05)，但均低于超声乳化组单个视野中的巨噬细胞数量[(16.10±5.30)个/视野](P<0.05)。

A.PBS组;B.5 000 r/min组;C.10 000 r/min组;D.15 000 r/min组;E.20 000 r/min组;F.25 000 r/min组;G.超声乳化组。n=5，F=20.976，P=0.000。

3 讨论

MF59通常采用超声乳化的方法制备[10]，本研究发现，在单位时间内不同功率的超声乳化制备的MF59颗粒大小无显著差异，不同转速匀浆的方法可生成不同的颗粒大小，而分子的理化性质是影响免疫应答的因素之一[11]，为验证不同颗粒大小的MF59对其免疫学效应影响，我们检测了Th1、Th2细胞分泌的主要细胞因子IFN-γ和IL-4含量。动物实验结果表明，5 000～15 000 r/min制备的MF59颗粒较大，在局部可减少IgE抗体及IL-4的生成，而IFN-γ的分泌则增多，说明大颗粒的MF59易诱导Th1方向的免疫应答，而>20 000 r/min及超声乳化制备的小颗粒MF59则易诱导Th2方向的免疫应答。因此我们推测，MF59颗粒的大小是影响Th1/Th2免疫应答偏移的因素之一。产生此结果可能的原因是：MF59能有效摄取抗原并转运至引流区淋巴结[12]，大颗粒的MF59表面积及表面张力较小颗粒的MF59大，可摄取较多的卵清蛋白至淋巴结，从而减少抗原在外周血中的浓度，减少其产生过敏反应的概率及IgE抗体含量，即大颗粒MF59不易诱导Th2型免疫应答。同时值得注意的是，5 000 r/min和10 000 r/min条件下制备的大颗粒的MF59稳定性欠佳，因此在研究时应现配现用。

有研究发现，MF59发挥免疫学活性的关键机制有：①MF59在注射局部具备瞬时免疫活性，可诱导形成免疫活性环境[5，13]。②诱导内源性ATP瞬时释放，并在注射局部迅速募集巨噬细胞、单核细胞、中性粒细胞、抗原提呈细胞、树突状细胞等免疫细胞[12]。③作用于巨噬细胞和粒细胞，促进趋化因子的分泌，促进免疫细胞迁移到注射局部；同时利于抗原提呈细胞摄取抗原，并输送至引流区淋巴结，启动获得性免疫应答[13]等。本研究在检测不同匀浆速度下制备的MF59在注射局部募集巨噬细胞的能力时，PBS组、5 000 r/min组及10 000 r/min组的各组织切片中均未观察到巨噬细胞，可能由于检测技术的局限性，并不代表上述3组完全没有募集巨噬细胞的能力；15 000～25 000 r/min组和超声乳化组仅在皮下组织切片中观察到巨噬细胞，且募集巨噬细胞的能力随着颗粒直径的减小而增加，其中超声乳化组募集巨噬细胞数量最多，说明颗粒大小影响其招募巨噬细胞的能力。造成此结果可能的原因是：小颗粒的MF59在皮下吸收、转运及扩散的能力强于大颗粒，增大扩散面积的同时增加了被巨噬细胞捕捉到的机会。有研究发现[14]，应用MF59为佐剂进行皮下免疫，注射后24 h利用流式细胞术检测到注射部位肌肉组织中巨噬细胞含量显著增高；而本研究中未检测到，这可能是检测技术的灵敏度不同造成的。

综上所述，本研究发现不同匀浆速度下制备的MF59可能会改变Th1/Th2免疫应答偏移，总体上呈现较低转速匀浆制备的大颗粒MF59易于诱导Th1免疫应答偏移，而高转速匀浆或超声乳化制备的小颗粒MF59易于诱导Th2免疫应答偏移，但大颗粒的MF59募集巨噬细胞的能力弱于小颗粒且稳定性欠佳。因此，我们在实验研究中，可根据不同疫苗免疫保护的具体需要，使用不同颗粒大小的MF59为佐剂，实现定向诱导Th1/Th2免疫应答的偏移，从而加强疫苗免疫保护效果。