缬沙坦对大鼠急性肝衰竭的保护作用及其机制研究

李建州 刘小静 叶 峰 李晓青

1.西安交通大学第一附属医院感染科，陕西西安 710061；2.西安交通大学第一附属医院急诊科，陕西西安 710061

急性肝衰竭（acute liver failure，ALF）表现为在短时间内发生大量肝细胞坏死，病情进展迅速，病死率高，发病机制尚不十分清楚[1]。大量研究表明，肾素-血管紧张素系统（RAS）不仅能够维持血压和体液平衡，还能够调节炎症、凋亡和纤维化等病理过程，与各种肝病的发生发展密切相关[2-3]。RAS 阻断剂的应用可为肝脏疾病的治疗提供新思路，但目前关于其在肝衰竭中的研究报道甚少。本研究通过D-氨基半乳糖（DGalN）/脂多糖（LPS）联合腹腔注射诱导大鼠急性肝衰竭模型，采用缬沙坦进行干预，探讨缬沙坦对急性肝衰竭的保护作用及其分子机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

购买180～200 g 的清洁级雄性SD 大鼠60 只，辽宁长生生物技术有限公司，合格证号：2107262001001 67346；生产许可证号：（辽）SCXK2020-0001。饲养及实验过程严格遵守实验动物伦理相关规定。所有实验动物于20～25℃室温饲养1 周后进行实验，实验前禁食12 h。

1.2 主要试剂

D-GalN（货号：G0500）与LPS（货号：L2630）购自美国Sigma-Aldrich 公司。缬沙坦（货号：V129241）购自上海阿拉丁生化科技有限公司。血管紧张素Ⅱ（AngⅡ，货号：E-EL-R1430c）、血管紧张素1-7（Ang 1-7，货号：E-EL-R1138c）、肿瘤坏死因子α（TNF-α，货号：E-EL-R2856c）、白细胞介素-6（IL-6，货号：EEL-R0015c）酶联免疫吸附试验试剂盒，CD68 抗体（货号：22225-1-AP），抗髓过氧化物酶（MPO）抗体（货号：28058-1-AP）均购自武汉三鹰生物技术有限公司。RNA 提取试剂（货号：252250AX）、荧光定量PCR 试剂盒（货号：ET105-01）均购自北京天根生化科技有限公司。CHOP（货号：15204-1-AP）、GRP78（货号：11587-1-AP）一抗均购自上海艾博抗贸易有限公司，辣根过氧化物酶标记二抗（货号：BA1051）购自武汉三鹰生物技术有限公司。

1.3 实验分组及处理方法

采用随机数字表法将实验动物分为正常对照组、肝衰竭组、缬沙坦组，每组各20 只。缬沙坦组腹腔注射缬沙坦（25 mg/kg），30 min 后腹腔注射D-GalN（0.8 g/kg）/LPS（20 μg/kg）；肝衰竭组腹腔注射等量生理盐水，30 min 后腹腔注射D-GalN（0.8 g/kg）/LPS（20 μg/kg）；正常对照组腹腔注射等量生理盐水，30 min后再次注射等量生理盐水。造模10 h 后每组随机取10 只大鼠统一处死，采血并分离血清，同时留取肝脏组织，冻存备检。继续观察剩余大鼠并记录其存活时间。

1.4 观察指标及检测方法

1.4.1 生化指标及炎症因子的检测 采用生化分析仪（Rayto，Chemray 240）检测大鼠血清中的谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）水平。酶联免疫吸附试验检测大鼠血清或肝组织中TNF-α、IL-6、AngⅡ、Ang 1-7水平。

1.4.2 HE 染色 留取肝脏组织于10%甲醛溶液中固定，按常规步骤进行石蜡包埋、切片、HE 染色，于光学显微镜下观察肝脏病理变化。

1.4.3 免疫组化检测炎症细胞浸润 取石蜡包埋的大鼠肝脏标本，按常规步骤，经切片脱蜡、抗原修复、封闭、加MPO（1∶100 稀释）或CD68（1∶100 稀释）一抗、二抗（1∶10 000 稀释）、显色、苏木精复染、脱水、封片等步骤，最后在光学显微镜下观察，采集图像，蓝色为细胞核，棕褐色为目标蛋白。

1.4.4 荧光定量PCR 检测 采用Trizol 法提取肝脏组织的总RNA，逆转录成cDNA，应用ABI 7500 荧光定量PCR 仪（型号：QuantStudio 6）进行反应，反应体系为cDNA 4 μL，上下游引物各0.4 μL，qPCR 预混液10 μL、超纯水5.2 μL。反应条件为50℃2 min，95℃10 min，95℃30 s，60℃30 s，40 循环，以2-△△Ct进行分析。β-actin 正向引物为5’-CACGATGGAGGGGCCGGACTCATC-3’，反向引物为5’-TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT-3’，扩增条带为240 bp。GRP78正向引物为5’-ACGACCCCTGACAAAAGACA-3’，反向引物为5’-GTCAGGCGGTTTTGGTCATT-3’，扩增条带为195 bp。CHOP 正向引物为5’-CCCCAGGAAACGAAGAGGAA-3’，反向引物为5’-CGCACTGACCACTCTGTTTC-3’，扩增条带为210 bp。

1.4.5 Western blot 蛋白印迹分析 每组随机选取5 只处死大鼠留取的肝脏组织标本，按常规步骤提取总蛋白、测定蛋白浓度，后进行SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳，经转膜、封闭、孵育一抗（1∶2000 稀释）、二抗（1∶20 000 稀释）等步骤，最后用ECL 液显色检测蛋白信号，用Band Scan 图像分析软件分析各阳性条带的积分灰度值，分别计算GRP78、CHOP 与内参β-actin 的灰度值之比作为其蛋白相对含量值。

1.5 统计学方法

采用SPSS 20.0 对所得数据进行统计学分析，计量资料采用均数±标准差（）表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较比较采用LSD-t 检验，生存分析采用Log-Rank 检验。以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三组存活情况比较

肝衰竭组在28 h 内全部死亡，正常对照组无死亡，缬沙坦组72 h 的存活率高于肝衰竭组，差异有高度统计学意义（P ＜0.01）。见图1。

图1 三组生存曲线比较（n=10）

2.2 三组血清及肝脏组织中AngⅡ、Ang 1-7、AngⅡ/Ang 1-7 比值比较

肝衰竭组血清和肝脏组织的AngⅡ、AngⅡ/Ang 1-7比值均高于正常对照组，血清中Ang 1-7 高于正常对照组，肝脏组织中Ang 1-7 低于正常对照组，差异有高度统计学意义（均P ＜0.01）。缬沙坦组大鼠血清和肝脏组织的AngⅡ、AngⅡ/Ang 1-7 比值均低于肝衰竭组，Ang 1-7 均高于肝衰竭组，差异有高度统计学意义（均P ＜0.01）。见图2。

图2 三组AngⅡ、Ang 1-7、AngⅡ/Ang 1-7 比值的比较（n=10）

2.3 三组血清生化指标及炎症因子比较

肝衰竭组血清ALT、AST、TNF-α、IL-6 水平均高于正常对照组，差异有高度统计学意义（均P ＜0.01）。缬沙坦组血清ALT、AST、TNF-α、IL-6 水平均低于肝衰竭组，差异有高度统计学意义（均P ＜0.01）。见图3。

图3 三组血清生化指标及炎症因子的比较（n=10）

2.4 三组肝组织病理的变化

HE 染色结果显示，正常对照组肝脏组织小叶结构清晰，肝细胞围绕中央静脉呈放射状排列；肝衰竭组肝脏组织部分肝小叶结构紊乱，肝细胞变性坏死严重，缬沙坦组肝脏组织肝细胞变性坏死较肝衰竭组减少，见图4A（封三）。免疫组化结果显示，缬沙坦组肝组织汇管区MPO 和CD68 阳性的炎症细胞较肝衰竭组减少，见图4B、C（封三）。

图4 三组肝脏组织病理染色

2.5 三组肝脏组织GRP78、CHOP 表达水平比较

肝衰竭组肝脏组织中GRP78、CHOP 的mRNA 及蛋白表达水平均高于正常对照组，差异有高度统计学意义（均P ＜0.01）。缬沙坦组肝脏组织中GRP78、CHOP 的mRNA 及蛋白表达水平均低于肝衰竭组，差异有高度统计学意义（均P ＜0.01）。见图5。

图5 三组肝脏组织GRP78、CHOP 表达水平比较

3 讨论

近年来研究发现，RAS 与肝炎、肝硬化等各种肝脏疾病的发生发展密切相关[4-5]。目前认为血管紧张素转换酶-AngⅡ-血管紧张素Ⅱ1 型受体（ACE-AngⅡ-AT1R）轴是RAS 的主要功能轴，而AngⅡ是其中的核心分子，可以通过特异性结合AT1R 发挥促炎症、促纤维化效应[6-10]。同时，在体内AngⅡ也能够被ACE2 裂解成Ang 1-7，后者可以与Mas 受体结合发挥抗炎、抗纤维化作用[11-12]。研究表明，AngⅡ能够刺激巨噬细胞分泌IL-6、TNF-α，其本身也是一种重要的炎症因子[13-16]。而IL-6、TNF-α 则是肝损伤中重要的促炎性细胞因子，能够诱导肝细胞凋亡及坏死，加重肝脏炎症[17-19]。AT1R 阻断剂（ARB）可以从受体水平选择性阻断AngⅡ与AT1R 结合，从而拮抗AngⅡ的生物学效应。目前关于ARB 在肝纤维化、肝硬化中的应用研究较多，但其在肝衰竭中的作用报道甚少[2-3]。本研究发现，在急性肝衰竭病理状态下，血清及肝组织中的AngⅡ及AngⅡ/Ang 1-7 水平均明显升高，提示存在ACE-AngⅡ-AT1R 轴的激活。而缬沙坦干预后，急性肝衰竭大鼠的肝功能损伤明显减轻，TNF-α、IL-6等细胞因子水平低于肝衰竭组，肝脏组织中肝细胞坏死及炎症细胞浸润明显减轻。以上实验结果表明，急性肝衰竭时存在RAS 的激活，缬沙坦能够通过阻断RAS 发挥抗炎效应，对急性肝衰竭具有保护作用。

然而对于缬沙坦抗炎作用的具体机制尚不明确。越来越多的研究显示，内质网应激（endoplasmic reticulum stress，ERS）与多种肝脏疾病如病毒性肝炎、酒精性肝病、肝衰竭等密切相关[20-24]。适度的ERS 有利于维持内环境的稳态，持续或过度的ERS 则会影响内质网的结构或功能，激活下游相关的信号通路，继而诱导炎症、凋亡，最终导致脏器的损伤[25]。有研究表明，AngⅡ与AT1R 结合可以激活肾脏细胞的ERS 促进其凋亡，而ARB 可以通过抑制ERS 对糖尿病大鼠发挥肾脏保护作用，因此推测在肝衰竭中同样存在这种现象[26]。实验结果显示，急性肝衰竭大鼠肝脏中ERS 标志分子GRP78、CHOP 水平明显升高，提示存在过度的ERS，这与既往的研究报道一致[27]。而缬沙坦干预后肝衰竭大鼠肝脏组织中GRP78、CHOP 的表达水平明显下调，提示ERS 激活水平的下降。因此本研究提示，在急性肝衰竭时，缬沙坦可能通过阻断RAS抑制肝脏内的ERS 水平，进而抑制ERS 下游相关的炎症通路，减轻细胞因子风暴，最终发挥抗炎保肝作用，但其具体作用机制仍有待于更深一步的研究。

综上所述，缬沙坦可能通过阻断RAS，能够对急性肝衰竭产生保护作用，其作用机制可能与抑制肝脏的ERS 水平有关，阻断RAS 可能为急性肝衰竭的治疗提供新的思路。