miR-181a-5p在宫颈癌组织及患者血清中的表达及临床意义

陈 嫣，胡 萃，欧阳佩琳

湖南省妇幼保健院妇产科，湖南长沙 410008

我国每年宫颈癌新发病例约13万例，该病呈年轻化趋势[1-2]。因此，探究宫颈癌分子生物学机制，明确临床诊疗靶点意义重大。miRNA为一类非编码小RNA，可在转录后调控靶基因表达[3]。临床研究显示，miRNA可通过影响肿瘤细胞的增殖、凋亡、迁移等参与肿瘤的发生、发展，且其在宫颈癌等多种肿瘤组织中表达异常[4]。本研究组前期利用芯片技术检测了宫颈癌细胞培养的肿瘤球与贴壁细胞差异表达的miRNA，其中，miR-181a-5p差异表达较明显，且肿瘤球中miR-181a-5p表达下调。因此，为进一步探究miR-181a-5p在宫颈癌发生、发展中的作用，本研究对110例宫颈癌患者进行研究，现报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2018年6月至2020年10月本院收治的宫颈癌患者110例为宫颈癌组，年龄39～74岁，平均(56.49±8.26)岁。纳入标准：(1)均为初发病例；(2)均接受手术治疗且经病理确诊：(3)术前未接受放化疗等治疗。排除标准：排除合并严重感染性疾病、严重心肝肾等功能障碍者。另选取100例本院的体检健康女性为对照组，年龄36～71岁，平均(57.86±7.41)岁。本研究经本院伦理学委员会审批，入组对象均知情同意。

1.2方法

1.2.1标本采集 收集宫颈癌患者术中癌组织及对应癌旁组织，经液氮冷冻处理后，保存于-80 ℃冰箱待检。采集空腹静脉血4 mL，1 500 r/min离心10 min后，留取血清保存于-80 ℃冰箱待检，宫颈癌患者于术前采集，对照组于体检当日采集。

1.2.2总RNA提取 取组织标本100 mg及血清标本400 μL，组织标本先经超声匀浆，应用RNA提取试剂盒(购自杭州新景生物公司)分别提取组织标本和血清标本中总RNA，经DEPC水溶解，应用南京菲勒公司生产的分光光度计测定RNA的浓度和纯度。

1.2.3反转录 按照反转录试剂盒(购自上海联迈生物公司)说明书进行操作，将组织标本及血清标本中miR-181a-5p反转录为cDNA，反应体系如下：总RNA样品2 μL、反转录酶1 μL、上下游引物各1 μL、核糖核酸酶抑制剂0.5 μL、5倍缓冲液4 μL、dNTPs混合物(10 mmol/L)1 μL，加入RNase Free H2O补至20 μL。反应条件：16 ℃ 15 min，42 ℃ 30 min，85 ℃ 10 min，4 ℃ 5 min，产物置于4 ℃保存。

1.2.4PCR扩增反应 应用LEPGEN-96实时荧光定量PCR仪(购自北京乐普医疗科技公司)，按照PCR试剂盒(购自上海联迈生物公司)说明书操作，反应体系如下：已稀释的cDNA 2 μL、上下游引物各2 μL、SYBR GREENⅠ荧光染料12.5 μL，加双蒸水补至20 μL。反应条件：95 ℃ 30 s，1个循环，95 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，60 ℃ 30 s，35个循环。miR-181a-5p及内参U6引物委托上海生工生物公司合成。miR-181a-5p上游引物序列：5′-TGAGGGCTAGAGACAAGCAG-3′，下游引物序列：5′-GTCAAGTGCACACGCGTGAC-3′；U6上游引物序列：5′-CGAGCGTTGACTCACCGTCA-3′，下游引物序列：5′-ACCTGTATTCTCGTGCTCAT-3′。应用公式2-ΔΔCt计算组织标本及血清标本中miR-181a-5p的相对表达水平。

2 结 果

2.1组织标本及血清标本中miR-181a-5p的表达分析 宫颈癌患者癌组织中miR-181a-5p的相对表达水平为9.41±2.38，明显低于癌旁组织的17.62±3.54，差异有统计学意义(t=20.198，P<0.05)，见图1。宫颈癌组血清中miR-181a-5p的相对表达水平为11.03±2.76，明显低于对照组的18.96±4.13，差异有统计学意义(t=16.492，P<0.05)，见图2。

图1 组织标本中miR-181a-5p的相对表达水平

图2 血清标本中miR-181a-5p的相对表达水平

2.2miR-181a-5p的表达与宫颈癌患者临床特征的关系 不同分化程度、有无淋巴结转移、不同国际妇产科联盟(FIGO)分期的宫颈癌患者癌组织标本及血清标本中miR-181a-5p的相对表达水平差异有统计学意义(P<0.05)；不同年龄、不同肿瘤最大径、是否绝经、不同病理分型的宫颈癌患者癌组织标本及血清标本中miR-181a-5p的相对表达水平差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

表1 miR-181a-5p的相对表达水平与宫颈癌患者临床特征的关系

2.3miR-181a-5p诊断宫颈癌的ROC曲线分析 癌组织中miR-181a-5p诊断宫颈癌的曲线下面积(AUC)为0.871(95%CI0.745～0.983，P<0.05)，灵敏度为94.42%，特异度为85.39%；血清中miR-181a-5p诊断宫颈癌的AUC为0.752(95%CI0.703～0.914，P<0.05)，灵敏度为89.19%，特异度为79.82%，见图3。

图3 miR-181a-5p诊断宫颈癌的ROC曲线

3 讨 论

宫颈癌为临床常见恶性肿瘤，既往研究显示，我国宫颈癌患者术后复发率和病死率较高[5]。因此，明确宫颈癌的早期诊疗靶标，探究其分子生物学机制意义重大。

miR-181a-5p为miR-181家族成员之一，其家族成员还包括miR-181a、miR-181b等序列，其中miR-181a-5p为成熟序列，已确定的靶标较多，如OPN、K-ras、SHP2等[6]。既往研究显示，miR-181a-5p与乳腺癌[7]、肺癌[8]、前列腺癌[9]等肿瘤密切相关，其在不同癌组织中表达异常。

本研究发现，与癌旁组织比较，宫颈癌癌组织中miR-181a-5p的相对表达水平降低，结果提示，miR-181a-5p在宫颈癌组织中呈低表达，这与基因芯片检测结果一致。此外，本研究发现与对照组比较，宫颈癌组血清中miR-181a-5p的相对表达水平降低，进一步证实了miR-181a-5p在宫颈癌组织及患者血清中表达下调。侯歌等[10]研究发现，抑制miR-181a-5p可增强宫颈癌细胞SiHa放射敏感性，促进癌细胞凋亡。另有研究报道，miR-181a-5p可调控肝癌细胞增殖，其在肝癌组织中表达明显下调[11]。

既往研究显示，miR-181a可影响卵巢细胞癌的侵袭及迁移行为[12]。本研究显示，不同分化程度、有无淋巴结转移、不同FIGO分期的宫颈癌患者癌组织标本及血清标本中miR-181a-5p的相对表达水平差异有统计学意义(P<0.05)。结果提示，分化程度越低、有淋巴结转移、FIGO分期越高的宫颈癌组织及患者血清中miR-181a-5p的相对表达水平越低，这说明miR-181a-5p与宫颈癌的恶性程度有关，其低表达可促进肿瘤细胞恶性转化，因此推测上调miR-181a-5p的表达可能是宫颈癌临床治疗的潜在靶点。王宏等[13]报道，宫颈癌组织中miR-181a表达下调，且表达与癌组织分期、分化程度有关。李瀚等[14]研究发现，宫颈癌组织中miR-181b表达明显低于正常宫颈组织，miR-181b可抑制肿瘤细胞的侵袭、迁移能力。刘琴等[15]研究报道，miR-181a在卵巢癌细胞中表达下调，其表达与FIGO分期、淋巴结转移有关。由以上研究可知，miR-181家族成员中miR-181a-5p、miR-181a、miR-181b与宫颈癌、卵巢癌等肿瘤有关。

通过ROC曲线发现癌组织中miR-181a-5p诊断宫颈癌的AUC为0.871(95%CI0.745～0.983，P<0.05)，灵敏度为94.42%，特异度为85.39%；血清中miR-181a-5p诊断宫颈癌的AUC为0.752(95%CI0.703～0.914，P<0.05)，灵敏度为89.19%，特异度为79.82%。结果提示，miR-181a-5p对宫颈癌临床诊断的特异度和灵敏度均较高。因此，推测miR-181a-5p可作为宫颈癌临床诊断的评价指标。

综上所述，miR-181a-5p在患者宫颈癌组织及血清中均呈低表达，且其表达与宫颈癌发生、发展有关，可能成为宫颈癌临床诊断的评价指标。今后本研究将扩大样本量，进一步探究miR-181a-5p的表达与宫颈癌患者临床病理特征的关系，并对相关机制进行深入研究。