miR-34c对巨噬细胞极化、晶体吞噬和迁移能力的调控研究*

瞿根义，徐 勇，阳 光

中南大学湘雅医学院附属株洲医院泌尿外科，湖南株洲 412007

肾结石是我国最常见的泌尿外科疾病之一，而湖南省是我国肾结石发病率最高的省份之一。草酸钙结石是最常见的肾结石类型，所占比例为70%～80%[1]，目前草酸钙结石的发病机制尚未完全阐明且缺乏有效的预防措施，治疗后复发率也很高。因此，深入探讨草酸钙结石的发病机制，寻找新的有效干预靶点，仍是肾结石治疗和预防的重点，且具有重要的科研和临床意义。

研究发现，巨噬细胞可明显促进细胞的晶体吞噬作用并减少肾脏晶体数量[2]。OKADA等[3]在草酸钙结石大鼠模型中发现草酸钙晶体诱导肾小管上皮细胞损伤后，巨噬细胞在骨桥蛋白、CD44、纤维连接蛋白介导下，吞噬并消化晶体。并且研究证实草酸钙晶体可以诱导人肾小管上皮细胞miRNA表达谱发生明显的改变，且miRNA在调节巨噬细胞极化过程中扮演着重要角色[4]。同时有研究表明miR-34c对巨噬细胞形成具有调控作用[5]。因此，本研究拟探讨miR-34c对巨噬细胞极化分型、晶体吞噬作用和迁移能力的影响及其作用机制，为临床预防和治疗肾结石提供一定依据。

1 材料与方法

1.1主要材料与试剂 小鼠巨噬细胞(Ana-1细胞)和小鼠肾小管上皮细胞(NRK-52E细胞)购自上海中科院细胞库；miR-minics和miR-inhibitor及其相应空白对照(pre-miR-NC和anti-miR-NC)慢病毒重组质粒购自上海吉玛制药技术有限公司；miR-34c、GAPDH试剂盒购自美国Ambion公司；CD80、CD86、CD163和CD206抗体均购自北京博奥森生物技术有限公司；DMEM培养基和胎牛血清购自德国Sigma公司；反转录试剂盒、Transwell试剂盒购自美国Invitrogen公司。

1.2方法

1.2.1细胞培养 将NRK-52E细胞和Ana-1细胞置于含10%胎牛血清的完全培养基中，于37 ℃、5% CO2的恒温培养箱中培养，选取对数生长期的细胞进行实验。并且取NRK-52E细胞接种于细胞培养皿并培养至细胞融合度在70%～80%后，加入终浓度为20 μg/cm2的一水草酸钙晶体处理24 h，收集细胞上清培养液用于后续实验。

1.2.2慢病毒转染实验 取对数生长期的Ana-1细胞接种到6孔板中，培养至细胞融合度达70%～80%，用枪头取5 μL含miR-minics和miR-inhibitor及其相应空白对照(pre-miR-NC和anti-miR-NC)慢病毒重组质粒的慢病毒液，分别与Lipofectamine2000转染试剂混合于培养基中，静置于室温下20 min后，将转染复合物加入6孔板中，每孔加入2 mL培养基，前后轻摇细胞板使溶液混合均匀，于37 ℃、5%CO2培养箱中培养4～6 h后，弃去原培养基，更换为2 mL含NRK-52E CM的培养基继续培养48 h。

1.2.3免疫印迹法(Western blot)检测Ana-1细胞极化 将慢病毒转染后培养的各组Ana-1细胞离心，于4 ℃，13 000 r/min离心15 min，取上清液置于新的小型离心管中。取2 μL样品，使用BCA法测定蛋白浓度。加缓冲液将样品蛋白浓度调至一致，加热至95 ℃变性5 min。将样品进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，通过转膜，封闭，一抗、二抗孵育，显影，分析条带灰度。M1型巨噬细胞的表面标志物为CD80和CD86，M2型巨噬细胞的表面标志物为CD163和CD206，内参为GAPDH，标志物与GAPDH比值代表Ana-1细胞极化情况。

1.2.4晶体吞噬作用检测 以上述慢病毒重组质粒分别感染Ana-1细胞24 h后，加入NRK-52E CM培养基处理36 h，添加丽春红标记的COM晶体(20 μg/cm2)继续处理48 h，普通光学显微镜下计数吞噬晶体的Ana-1细胞数量。

1.2.5Transwell迁移实验 将慢病毒转染后培养的各组Ana-1细胞以1×105个/孔的数量接种于Transwell小室的上室，上室为无血清培养基，下室分别以同体积DMEM和NRK-52E CM的培养基孵育24 h，多聚甲醛固定后进行结晶紫染色，置于显微镜下观察Ana-1细胞的迁移数量。

2 结 果

2.1miR-34c对Ana-1细胞极化的影响 Western blot结果显示，miR-minics组CD163和CD206相对表达水平明显高于pre-miR-NC组，miR-inhibitor组CD80、CD86相对表达水平明显高于anti-miR-NC组，差异均有统计学意义(P<0.05)。见图1、2。

注：A为Western blot显影图；B为各指标相对表达水平统计图；aP<0.05。

注：A为Western blot显影图；B为各指标相对表达水平统计图；aP<0.05。

2.2miR-34c的过表达和沉默对Ana-1细胞晶体吞噬能力的影响 普通光学显微镜下计数各组含吞噬晶体的Ana-1细胞数量，结果显示pre-miR-NC组含吞噬晶体的Ana-1细胞占比为(15.21±2.02)%,miR-minics组含吞噬晶体的Ana-1细胞占比为(45.38±4.93)%,anti-miR-NC组含吞噬晶体的Ana-1细胞占比为(15.49±2.45)%,miR-inhibitor组含吞噬晶体的Ana-1细胞占比为(6.71±1.56)%。miR-minics组中含吞噬晶体的Ana-1细胞比例明显高于miR-inhibitor组，差异有统计学意义(P<0.05)。见图3。

注：A为镜下含吞噬晶体的Ana-1细胞；B为含吞噬晶体的Ana-1细胞占比的统计图；aP<0.05。

2.3miR-34c的过表达和沉默对Ana-1细胞迁移能力的影响 Transwell迁移实验检测Ana-1细胞迁移能力，显微镜下观察Ana-1细胞的迁移数量，结果显示pre-miR-NC组Ana-1细胞的迁移数量为(35.58±3.57)个，miR-minics组Ana-1细胞的迁移数量为(80.29±5.18)个，anti-miR-NC组Ana-1细胞的迁移数量为(33.42±3.73)个，miR-inhibitor组Ana-1细胞的迁移数量为(17.63±4.34)个。miR-minics组中Ana-1细胞迁移数量明显高于miR-inhibitor组，差异有统计学意义(P<0.05)。

注：A为镜下Ana-1细胞迁移数量；B为Ana-1细胞迁移数量的统计图；aP<0.05。

3 讨 论

miRNA是在真核生物中发现的一类长度为20～25个核苷酸的具有调控功能的内源性非编码RNA。研究表明miRNA参与了包括生长发育、病毒防御、肿瘤发生及转移、细胞增殖和凋亡、脂肪代谢等多种生物学进程的调节[6]。有研究表明，草酸钙晶体刺激可以诱导人肾小管上皮细胞miRNA表达谱发生明显改变，而且发生表达变化的miRNA多与细胞炎性损伤、凋亡、线粒体功能及代谢功能密切相关[7]。HU等[8]研究发现，miRNA可能通过影响炎症因子的表达调控肾结石的形成。

巨噬细胞是一类不均一的由多个亚群组成的免疫细胞，在机体抵抗和组织修复等过程中发挥重要作用，是免疫系统的重要组分。巨噬细胞由血液中的单核细胞分化而来，并且普遍存在于血液、淋巴和组织中。近年研究发现，在实验性肾结石模型大鼠及肾结石患者的肾脏中，均发现晶体沉积的周围有大量单核/巨噬细胞浸润，提示单核/巨噬细胞也参与了肾脏内晶体沉积的过程[9-10]。并且有研究表明草酸钙晶体能够诱导人巨噬细胞发生剧烈的免疫反应，肾脏内的一水草酸钙晶体可被巨噬细胞降解并清除[11]。此外，基因芯片的分析结果也发现肾结石小鼠肾脏组织中巨噬细胞相关基因的mRNA表达明显增加，巨噬细胞细胞分为M1及M2 2种亚型，其中M1型具有促炎作用，而M2型具有抗炎作用，M1型巨噬细胞以分泌炎症因子为主，发挥促炎功能。常见的M1型巨噬细胞的表面标志物有HLA、CD80、CD86等。M2型巨噬细胞则以降低炎性反应和发挥组织修复功能为主，常见的M2型巨噬细胞的表面标志物有CD163和CD206等。本研究通过慢病毒转染过表达miR-34c，发现小鼠Ana-1细胞CD163和CD206表达增加，而CD80、CD86表达减少，并且在沉默miR-34c后，巨噬细胞表面标志物表达相反，证实了miR-34c可促进Ana-1细胞向M2型极化。巨噬细胞的极化现象广泛存在于肿瘤、肥胖、心血管疾病、自身免疫性疾病等疾病的发生发展过程中。巨噬细胞极化的平衡失调能反映局部组织的微环境炎症状态。最近有研究发现小鼠M2型巨噬细胞数量减少，肾脏草酸钙晶体的形成增加，而给小鼠注射M2型巨噬细胞后可明显减少肾脏晶体数量，证实了M2型巨噬细胞对结石形成有抑制作用[12]。本研究通过慢病毒转染，发现过表达miR-34c可促进巨噬细胞向M2型极化，并促进Ana-1细胞晶体的吞噬能力和迁移能力，而沉默miR-34c则抑制Ana-1细胞晶体的吞噬能力和迁移能力。KUSMARTSEV等[13]也证实M2型巨噬细胞可促进细胞的晶体吞噬作用，进一步证实了M2型巨噬细胞对结石形成的抑制作用。

综上所述，本研究通过慢病毒转染发现miR-34c调控巨噬细胞极化，促进巨噬细胞向M2型极化，通过慢病毒转染过表达miR-34c可以促进巨噬细胞吞噬晶体及迁移，表明miR-34c具有调控巨噬细胞极化，促进吞噬晶体及迁移的作用。