1例9p-四体综合征嵌合型胎儿的遗传学分析

邱显荣，申 瑶，林 萃

1.广东省珠海市妇幼保健院检验科，广东珠海 519001；2.广东省中医院珠海医院检验科，广东珠海 519015

非平衡嵌合体是导致胎儿先天性缺陷的原因之一，传统的细胞遗传学检查可能会漏检低水平的嵌合体，除非加大核型的分析数量。染色体微阵列分析(CMA)技术的应用能提高染色体异常嵌合的检出率，能检出嵌合比例为10%～20%的低水平嵌合[1-2]。衍生染色体，即由2条或以上染色体结构重排，或是由于单条染色体内发生多种畸变而产生，具有完整的着丝粒。但传统的G显带核型分析由于分辨率不高，很难确定衍生染色体片段的来源、大小和断裂点，更无法检测出染色体亚显微结构异常。本研究中，笔者联合应用核型分析与CMA技术，最终确定胎儿的嵌合比例与衍生染色体的来源，现报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 孕妇，32岁，配偶为非近亲。既往体健，否认家族遗传病史，孕5次，流产3次。曾足月顺产一男婴，健康。孕13周时无创产前DNA检测(NIPT)报告21、18、13-三体综合征低风险，但提示9号染色体部分重复，孕22+1周B超提示胎儿宫内发育迟缓，室间隔缺损、单脐动脉、不排除多囊肾、羊水少。孕妇在知情同意下行羊水穿刺术，抽取羊水同时做G显带核型分析和基因芯片检查。

1.2方法

1.2.1NIPT评估胎儿常见染色体非整倍体患病风险 用乙二胺四乙酸抗凝的离心管抽取孕妇外周血5 mL，2～8 ℃低温条件下离心分离血浆，-70 ℃以下超低温保存。采用磁珠法DNA提取试剂盒(深圳华大基因)抽提含有胎儿游离DNA的孕妇血浆DNA，使用胎儿染色体非整倍体(T21、T18、T13)检测试剂盒(深圳华大基因)对母血游离DNA进行特定序列接头连接、扩增及上机测序，然后通过与阳性判断值比较进行胎儿21、18、13号染色体非整倍体情况的判断。应用BGISEQ-500基因测序仪(深圳华大基因)进行测序，测序方法为联合探针锚定聚合测序法，测序深度为×0.1。

1.2.2G显带核型分析 对胎儿取20 mL羊水做常规G显带核型分析。用改良原位法培养制备染色体，G显带处理。非嵌合体计数20个核型，嵌合体计数100个核型。染色体核型按《2016人类细胞遗传学国际命名体制(ISCN)》描述。

1.2.3CMA 抽取羊水10 mL，采用QIAamp DNA Mini试剂盒(德国Qiagen公司)提取和纯化全基因组DNA，应用Affymetrix 750K试剂盒(美国ThermoFisher公司)对DNA进行酶切、连接、PCR扩增、纯化、片段化、标记、杂交等处理，最后应用配套的ChAS软件分析染色体的拷贝数变异(CNV)。CNV的分析标准是以50个标记、100 kb为最佳临界值进行分析；杂合性缺失或纯合状态以5 Mb的分辨率进行分析，包含明确印记致病基因的纯合状态区域报告标准染色体片段≥5 Mb，不包含明确印记致病基因的纯合状态区域报告片段为染色体片段≥10 Mb。

1.2.4荧光原位杂交技术(FISH)分析 采用广州和能生物科技有限公司生产的GSP PD-L1(Red)和CSP9(Green)探针进行原位杂交，经Zeise荧光显微镜观察，FISH软件照相分析荧光信号。

2 结 果

2.1NIPT检测结果 21、18、13-三体综合征筛查低风险，但9号染色体异常。

2.2核型分析结果 胎儿核型为47,Xn,+der(9)del(9)(q21q34)dup(9)(p12p24)[10]/46,Xn[90]。

2.3CMA检测结果 对羊水行CMA，胎儿在chr9p24.3p13.2位置检出一段约64.9 Mb的2.43拷贝重复，检测结果为arr[GRCH37]9P24.3P13.2(208454-68216577)x2-3，涉及DOCK8、KANAK1、DMRT1等164个OMIM基因。

2.4FISH验证结果 为9号染色体短臂定制探针，对CMA测序结果提示的chr9p24.3p13.2重复片段进行验证，发现二者结论一致，见图1。

注：箭头所示为chr9p24.3p13.2重复。

3 讨 论

9p-三体综合征由RETHOR等[3]应用显带技术识别证实并于1970年首次报道。1975年CENTERWALL等[4]确定了9p-三体综合征的畸变类型，其畸变大多数源自亲代的染色体平衡易位，少部分为新发突变。9p-四体综合征较罕见，在产前诊断羊水穿刺中9p-四体综合征的检出率约为0.002%[5]，9p-四体综合征中约30%为嵌合体[6]。其组成类型主要有：9号染色体整个短臂的等臂、整个短臂和长臂的部分异染色质区的等臂、整个短臂和长臂延伸到部分常染色质区的等臂。迄今为止，已经报道的9p-四体综合征仅60余例，其中产前诊断病例仅20例[7]。本研究中病例为9号染色体整个短臂的等臂i9(p)。产生机制多为减数分裂Ⅱ期不分离和重排，导致9p的重复和长臂的缺失，从而形成9p等臂，通常为母源性[8]。

9p-四体综合征的临床症状与9p-三体综合征相似，如生长发育迟缓、智力严重缺陷，具有眼间距宽、眼裂和嘴角下斜、环状耳等头面部异常[3]，先天性心脏病、中枢神经系统异常、肾脏异常、骨骼畸形、泌尿生殖器异常等[9-10]。但9p-四体综合征的存活率更低，表型更严重。许多9p-四体综合征的异常发现源于胎儿出现多种先天性异常而进行染色体核型分析。其中最常见的是巨脑室及Dandy-Walker畸形(60%)，其次依次为唇腭裂(55%)、宫内发育迟缓(45%)[11]。DHANDHA等[12]和NAKAMURA等[13]报道了被诊断为9p-四体综合征的产前超声异常还包括脑室增大、胼胝体发育不全、蚓部发育不全、椎体异常、心脏异常、泌尿生殖系统异常、肢体畸形、鼻骨缺失、先天性膈疝等。

9号染色体p22p24区是9p-四体综合征的关键区域。9p22.1p22.3区段重复具有典型颅面部异常，9p21.2p21.3区段重复与语言发育迟滞有关[14]。而9p22p24区段的DOCK8、KANK1、DMRT1、VLOLR基因明确与多种疾病及智力低下有关，KANK1的拷贝数变异与中枢神经系统缺陷有关。BOXILL等[15]认为9p区域包含一个或多个涉及脉络丛生长调控的基因，与9p-三体综合征相比，9p-四体综合征患者似乎更容易发生脉络丛增生。二者最常见的中枢神经系统异常是胼胝体异常和脑积水。DMRT1基因属于一个锌脂样的DNA结合序列(DM域)，DM域是脊椎动物性别决定途径中一个古老而保守的组成部分。当该基因出现CNV时，就会出现睾丸发育缺陷和XY女性化。VERHEIJ等[16]认为9号染色体上某些基因的超表达可能导致睾丸功能低下和泌尿生殖系统异常。VLDLR基因可以转导多种细胞外信号穿过神经细胞膜进入中枢神经系统，调节突触的可塑性并对海马的特殊学习和记忆功能具有重要作用。这些基因拷贝数的改变可能对智力和骨骼的发育产生影响[14]。本研究中胎儿核型的衍生染色体经过CMA确认为9p的重复。因其片段覆盖了9p-四体综合征的关键区域，故会呈现出与之相关的典型症状，是其发病的真正原因。

综上所述，对正在进行介入性产前诊断和基因检测的父母进行遗传咨询时，除了常见的染色体畸变外，还应包括罕见的，但在临床上同样重要的相关基因组。高分辨率全基因组扫描技术在临床中的应用将会明显提高不明来源复杂染色体畸变的诊断效率，能够为病因的解释、个体化的诊疗和遗传咨询提供科学合理的遗传学依据。