冷沉淀凝血因子Ⅷ检测的影响因素探讨*

方育如，孙爱农，林惠燕，郑晓兰，袁文声

广东省中山市中心血站质管科，广东中山 528400

冷沉淀凝血因子Ⅷ(Ⅷ因子)是冷沉淀中的主要成分，Ⅷ因子水平达标与否是冷沉淀血液质量抽检的关键控制点，是评估该成分血质量的重要参数。

按照国家对冷沉淀质量要求的相关规定[1-2]，采供血机构(血液中心/血站)每月至少要选取4袋冷沉淀用于质量抽检，其中Ⅷ因子水平合格率应≥75%。目前对Ⅷ因子水平影响因素的研究多集中在制备工艺上[3-4]，对试验检查影响因素较少关注。因此，本研究通过控制冷沉淀融解时间、使用合适的材质试管、设定试剂保存条件等，探讨冷沉淀凝血因子Ⅷ检测的影响因素，从而选择最佳试验条件，提高冷沉淀Ⅷ因子水平检测的准确性，现将相关研究结果报道如下。

1 材料与方法

1.1材料 随机选取中山市中心血站2020年1—12月制备的冷沉淀30袋。

1.2仪器与试剂 JXH-Ⅰ型冰冻血浆解冻箱购自广州金炫映公司；Coatron1800全自动血凝仪购自德国德高公司，所有仪器每年定期由厂家校准及维护；检测试剂为Ⅷ因子活性测定试剂(凝固法，批号547687A)、CaCl2溶液(批号563853)、校准品(批号503274B)、正常范围定值质控血浆(批号507765A)、缓冲液(批号554662)均购自德国西门子公司，并在有效期内使用；硬质塑料试管购自江苏晟康医疗用品有限公司(批号20190511)；一次性使用真空采血管(普通试管)购自浏阳市三力医用科技发展有限公司(批号201810)；枸橼酸钠(3.2%)真空采血管(涂膜血凝管)购自成都瑞奇医疗科技股份有限公司(批号20190637)。

1.3方法

1.3.1解冻时间选择 取出冷沉淀置于37 ℃水浴冰冻血浆解冻箱解冻槽内融解，观察每个设置时间点的融解和检测结果。

1.3.2关键试剂保存温度选择 将Ⅷ因子活性测定试剂分成2等份，分别作为24 ℃室温放置试剂、冰冻后37 ℃复苏试剂，检测前先对仪器进行定标，结果需符合线性要求，质控结果在控后进行留样检测。

1.3.3最佳保存温度和检测时间 取10份冷沉淀融解后分装放置于24 ℃室温、4 ℃、-25 ℃条件下贮存，并按照0、2、4、8、12、24 h检测时间进行检测，选择出最适保存温度和检测时间。

1.3.4Ⅷ因子检测可报告范围(最大稀释度) 选取1份冷沉淀Ⅷ因子检测结果接近预期上限的高浓度标本用缓冲液进行稀释，分别按稀释度为原液1∶1、1∶2、1∶3、1∶4进行检测，将结果均值与理论值进行比较得出相关系数R，R在0.8～1.2为可报告范围。

1.3.5高浓度Ⅷ因子标本的模拟制备 从一批已知Ⅷ因子检测合格的冷沉淀中，随机取1份37 ℃融解，分装到2支普通试管，1份即时进行Ⅷ因子检测，1份在-25 ℃条件下冰冻24 h后，取出直立放置室温自然融解，用塑料吸管从上中下层缓慢吸取分装后备检。

2 结 果

2.1解冻时间检测结果比较 取20袋冷沉淀进行融解并进行Ⅷ因子水平检测，肉眼观察到冷沉淀随融解时间延长，融解效果越好，10 min开始所有冷沉淀完全融解。融解10 min Ⅷ因子水平为(2.29±0.78)IU/mL；融解30 min Ⅷ因子水平为(2.05±0.63)IU/mL；融解60 min Ⅷ因子水平为(1.95±0.57)IU/mL；融解120 min Ⅷ因子水平为(1.81±0.50)IU/mL；与融解10 min的结果比较，30、60、120 min差异均有统计学意义(t=3.371、4.011、4.545，P=0.003 2、0.000 7、0.000 2)。

2.2最适材质试管选择 3种材质试管存放融解后冷沉淀10～30 min，检测Ⅷ因子水平。塑料试管Ⅷ因子水平为(1.797 0±0.402 0)IU/mL；普通试管Ⅷ因子水平为(1.880 5±0.376 4)IU/mL；涂膜血凝管Ⅷ因子水平为(1.527 0±0.275 7)IU/mL。塑料试管与普通试管比较差异无统计学意义(t=1.274，P=0.217 9)，涂膜血凝管与普通试管、塑料试管比较差异均有统计学意义(t=-6.228、-7.268，P<0.001)。

2.3关键试剂最佳保存温度选择 将Ⅷ因子活性测定试剂分为Ⅰ组和Ⅱ组，Ⅰ组24 ℃室温保存试剂2 h，Ⅱ组冰冻24 h后37 ℃复苏2 h，再进行Ⅷ因子水平检测，Ⅰ组Ⅷ因子水平为(2.01±0.51)IU/mL、Ⅱ组Ⅷ因子水平为(2.14±0.56)IU/mL，差异无统计学意义(P>0.05)。

2.4标本保存不同温度和时间的Ⅷ因子水平变化 冷沉淀融解后的标本储存在普通试管中，检测24 h内保存不同温度及时间的Ⅷ因子水平。-25 ℃保存条件，与0 h比较，2、4、8、12、24 h Ⅷ因子水平差异无统计学意义(P>0.05)；4 ℃保存条件，与0 h比较，12、24 hⅧ因子水平降低(P<0.05)；24 ℃保存条件下，与0 h比较，8、12、24 hⅧ因子水平降低(P<0.05)。见表1。

表1 标本保存不同温度和时间的Ⅷ因子水平变化

2.5Ⅷ因子检测可报告范围(最大稀释度) 结果显示，最大稀释度为1∶4，其中R值接近1最符合稀释要求(最大稀释度为1∶2)，见表2。

表2 标本不同稀释度Ⅷ因子水平结果

2.6高浓度Ⅷ因子标本的模拟制备 Ⅷ因子水平立即检测为1.41 IU/mL，在冰冻融解后上、中、下层水平分别为0.28、1.32、2.62 IU/mL。

3 讨 论

冷沉淀是临床输血治疗的一种重要血液成分，主要用于预防和治疗出血性疾病，先天性或获得性凝血因子Ⅷ缺乏症，对凝血功能疾病起着非常重要的作用，还适用于烧伤、肿瘤、皮肤黏膜疾病、弥散性血管内凝血和手术创伤等[5-6]，在临床治疗中取得了明显的效果；血液质量是保障临床治疗效果的前提，因此，血站对成分血液质量抽检起到重要的保障作用。

有研究报道，使用冷沉淀凝血因子制备仪制备的冷沉淀中Ⅷ因子水平明显高于低温融解箱制备的[4-7]，目前，本站采用全自动冷沉淀制备仪制备冷沉淀，减少人为操作失误因素对质量的影响。冷沉淀制备技术提高了冷沉淀中Ⅷ因子检测的准确性，在保证融解效果的同时控制了解冻时间[8-10]。本研究显示，冷沉淀置于37 ℃水浴解冻，随融解时间延长Ⅷ因子水平明显下降，差异有统计学意义(P<0.05)，融解时间控制在10 min最佳，这与相关研究报道基本一致[11]。

在检测仪器正常状态情况下，标本处理及检测试剂处理是影响检测结果的两大主要因素[12]，曾有研究表明采用促凝真空管，尤其是分离胶促凝真空管进行急诊生化项目检测时，凝血时间短，无挂壁[13]。本研究发现，留取融解的冷沉淀选择普通试管和塑料试管最佳，涂膜血凝管较差。理论上，涂膜血凝管可减少对蛋白质的吸附，应该较另外2种试管检测Ⅷ因子结果更优。但是，从本研究检测结果对比分析发现，普通试管与塑料试管Ⅷ因子水平较高，涂膜血凝管Ⅷ因子水平明显较低，说明选择冷沉淀标本留样试管前，应该充分进行试验，评估其对Ⅷ因子的影响，不能仅靠厂家的资料宣传。本研究中24 ℃室温放置试剂、冰冻后37 ℃复苏试剂，Ⅷ因子水平比较差异无统计学意义(P>0.05)，提示日常工作中Ⅷ因子活性测定试剂可于室温保存，如特殊原因不能当时完成检测的，可以立即将试剂分装冷冻保存，至少24 h内复苏后可立即使用。

在日常血液质量抽检工作中，标本保存温度和检测时间也应受到重视。我国对融解后冷沉淀的保存温度规定2～6 ℃储存24 h[1]，这是为了最大程度方便临床使用而不轻易报废成分血，但国外已在研究融解后的冷沉淀在冷藏和室温下保存35 d的止血特性[14]，提示今后可以开展进一步研究。本研究试验结果充分表明，保存温度和时间会影响Ⅷ因子检测结果，冷沉淀融解取样后，须尽快检测，4 ℃和24 ℃条件下，检测时间应该控制在8～12 h内，对于短时间无法检测的应该立即将冷沉淀样品冰冻保存24 h内复苏检测。

由于冷沉淀中Ⅷ因子较普通血标本高，需要掌握标本最佳稀释度。本研究结果表明最佳稀释比例为1∶2。

综上所述，采供血机构对冷沉淀中Ⅷ因子抽检应该采用适当的检测方法，减少试验干扰因素，提高冷沉淀检测的合格率，避免因Ⅷ因子抽检结果偏低而导致血液不必要的报废。