冻融辅助碱提法提取蛹虫草蛋白的条件优化

蒋 益 郑惠华 刘广建* 薛 璟 季宏更 张 辰 张 蕾

（1江苏省苏微微生物研究有限公司，江苏无锡214063；2江苏安惠生物科技有限公司，江苏南通226009）

蛹虫草（Cordycepsmilitaris）别名北冬虫夏草、北虫草，与冬虫夏草同属异种[1]。野生的蛹虫草分布范围广，但数量稀少，十分珍贵。人工培育的蛹虫草化学成分与野生冬虫夏草相似，目前已被卫健委药食两用名单收入。研究表明蛹虫草蛋白含量丰富，其中必需氨基酸的种类齐全，比例适宜，同时含有多糖、核苷、甾醇等多种功效成分[2-3]。

食用菌的蛋白质量分数一般为干重的20%~40%，高于大多数食品，且氨基酸组成平衡合理，比植物蛋白更全（植物性蛋白常缺少1种或2种必需氨基酸），比动物蛋白安全（动物蛋白常含大量脂肪和胆固醇），还含有一些稀有氨基酸。但目前对食用菌蛋白的研究仍然较少，市场上很少见到以食用菌蛋白为主原料的产品。蛹虫草的粗蛋白质量分数约为30%，氨基酸的种类齐全，营养价值高，是优质的新型蛋白质资源。当前蛹虫草深加工产品主要是虫草素、多糖、腺苷等活性成分。研究考察了冻融辅助碱提法中各因素对蛹虫草蛋白提取率的影响，并对所提取蛋白的氨基酸组成进行了分析，以期为食药用菌类蛋白质的开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

（1）供试原料：蛹虫草子实体超微粉（300目）由江苏省苏微微生物研究公司提供（粗蛋白质量分数为30.18%）。

（2）试剂：牛血清白蛋白，国药集团化学试剂有限公司；考马斯亮蓝G-250、浓盐酸、H3BO3、NaOH等，均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

pH计（PB-10），赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；冷冻干燥机（FD-1-80），北京博医康实验仪器有限公司；冷冻离心机（GL-21M），湘仪离心机仪器有限公司；凯氏定氮仪（KjeltecTM 8100），福斯分析仪器公司；紫外可见分光光度计（Alpha-1500），上海谱元仪器有限公司；氨基酸分析仪（L-8900），日本日立有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 蛹虫草蛋白碱提工艺流程

蛹虫草粉→单因素处理→9 000 r／min离心15 min→上清液调pH至等电点酸沉→9 000 r／min离心15 min，中和→冷冻干燥→粗蛋白提取物

1.3.2 碱提单因素试验

固定基础提取条件：pH为11、提取温度为30℃、料（g）液（mL）比为1∶20、提取时间为2 h。分别进行pH、提取温度、提取时间、料液比单因素试验，以确定后续试验的因素与水平。

1.3.3 反复冻融单因素试验

称取一定量的蛹虫草粉，按料（g）液（mL）比1∶20加水，调pH为11，分别置于-20℃低温冰箱与-80℃超低温冰箱中完全冻结后取出于室温解冻，此为冻融1次，如此冻融1次、2次、3次、4次后将液体按1.3.2中的基础条件提取蛋白，以不经冻融为对照，确定最佳冻融数。

1.3.4 正交优化设计

根据单因素试验结果，以蛋白提取率为考察指标，设计L9（34）正交试验表，对提取工艺参数进行优化。

1.3.5 蛋白提取率的测定

提取液中蛋白含量的测定采用Bradford法[4]，蛹虫草粉样品的蛋白含量测定参照国标GB 5009.5—2016《食品中蛋白质的测定》中凯氏定氮法[5]。根据以下公式计算提取率：

1.3.6 蛹虫草蛋白等电点（pI）的测定

等电点的测定参照刘广建等[6]的方法。

1.3.7 氨基酸组成分析

参照GB 5009.124—2016《食品中氨基酸的测定》[7]中方法。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 pH对蛹虫草蛋白提取率的影响

由图1可知，在pH低于12时，蛹虫草蛋白提取率随pH的上升而升高，其中pH 10~12时，提取率上升趋势明显，在pH 12时提取率最高，为32.85%，之后蛋白的提取率有所下降。说明蛹虫草蛋白质大部分是碱溶性蛋白，pH上升使得更多的蛋白质溶出；同时碱液还能破坏蛋白质分子的次级键尤其是氢键，并使某些极性基团发生解离，使蛋白质表面分子带有相同的电荷，促进了蛋白质的溶出[8]。考虑pH高于12，会引起蛋白质变性，因此选取pH 11、11.5、12进行后续正交试验。

图1 pH对蛹虫草蛋白提取率的影响

2.1.2 提取温度对蛹虫草蛋白提取率的影响

由图2可见，提取温度为20℃时，蛹虫草蛋白提取率较低，仅为15.55%，温度为20~40℃时，蛋白提取率上升趋势明显；温度为40~50℃时，提取率升幅减缓，温度为50℃时，提取率最高，为27.58%；温度高于50~70℃时，提取率几乎无变化。可见在一定提取温度范围内，温度的升高会促进蛋白质的溶出。因提取温度为40℃、50℃时，蛋白提取率变幅不大，从节省能耗考虑，选取35、40、45℃，进行之后的正交试验。

图2 提取温度对蛹虫草蛋白提取率的影响

2.1.3 提取时间对蛹虫草蛋白提取率的影响

由图3可见，随着提取时间的延长，蛹虫草蛋白提取率先上升后趋稳。提取时间为1 h时，提取率非常低，说明提取时间太短，料液无法充分作用，蛋白质不易溶出；提取时间在1~3 h，随着提取时间的延长，蛋白提取率快速上升，提取时间3 h时，提取率为25.44%。考虑提取时间因素的结果已非常明显，因此固定提取时间为3 h，不将提取时间作为正交优化试验因素。

图3 提取时间对蛹虫草蛋白提取率的影响

2.1.4 料液比对蛹虫草蛋白提取率的影响

由图4可知，当料（g）液（mL）比为1∶10时，蛹虫草蛋白提取率仅有9.76%，之后随着料液比的上升，蛋白提取率明显上升；但料液比大于1∶25后，蛋白提取率几乎不变。故选用料液比1∶20，1∶25、1∶30这3个水平进行后续正交试验。

2.1.5 反复冻融对蛹虫草蛋白提取率的影响

冻融法主要是利用冷冻过程中形成的胞内冰晶在融化时使细胞膨胀而破壁，反复多次从而使得目的产物更多的溶出，属物理破壁技术，操作简便且不破坏有效成分[9]。由图5可知，-20℃低温组与-80℃超低温组的蛹虫草蛋白提取率都比未经冻融有所上升，两种冷冻温度相同冻融次数的蛋白提取率差异不明显；冻融次数的增加，两种冷冻温度的蛋白提取率都逐步上升，冻融3次、4次时提取率最高，为25%左右，但两种冷冻温度相同冻融次数，蛋白提取率差异很小。基于简化操作和节能考虑，选择-20℃冻融2次、3次、4次进行后续正交试验。

图4 料液比对蛹虫草蛋白提取率的影响

图5 冻融次数对蛹虫草蛋白提取率的影响

2.2 冻融辅助碱提法正交优化结果

在单因素试验的基础上，选择料液比、pH、冻融次数、提取温度进行四因素三水平正交试验（表1、表2）。

表1 L 9（34）正交试验因素水平

由表2可知，B（pH）因素对蛹虫草蛋白提取率影响最大（R值最高）。各因素对蛹虫草蛋白提取率影响依序为B>A>D>C（即pH>料液比>温度>冻融次数），最佳组合为A3B3C2D2，即最适条件为料（g）液（mL）比1∶25，pH 12，冻融3次，提取温度40℃。因此，试验冻融辅助碱提法提取蛹虫草蛋白的最佳条件为料（g）液（mL）比1∶25，-20℃反复冻融3次，pH 12，提取温度40℃，提取时间3 h。验证试验，此条件蛹虫草蛋白提取率为35.34%。

表2 L 9（34）正交试验结果

2.3 蛹虫草蛋白等电点

实际试验过程中，pH很难调节到正好预设的点，而过多的酸碱调节会影响待测液体体积从而影响各pH下吸光值的比较，因此操作中尽量调到接近即可。由图6可知，当pH为3.50左右时，上清液吸光值最低，说明此时液体中残存蛋白最少，故pH 3.50为蛹虫草蛋白的等电点。此pH条件下，4℃沉淀过夜，按最佳条件提取的蛋白离心后调节pH至中性，经冷冻干燥后得到粗蛋白质量分数为47%的蛹虫草蛋白粉。

图6 蛹虫草蛋白等电点

2.4 蛹虫草蛋白氨基酸组成

蛹虫草蛋白氨基酸测定结果见表3。

由表3可知，试验所提蛹虫草蛋白富含17种氨基酸，其中质量分数前三的氨基酸为谷氨酸、天冬氨酸、亮氨酸，分别为6.18%、5.58%、4.02%，与朱丽娜等测定的蛹虫草氨基酸组成结果一致[2]。因采用酸水解制样，酸水解会破坏色氨酸，因此色氨酸未能检测到，而其他必需氨基酸种类齐全，且必需氨基酸占氨基酸总量的42.60%，符合FAO/WHO提出的理想蛋白质E/T应达40%的标准[10]。部分氨基酸评分（AAS）不高是由于此蛋白质还仅是粗提物，有待于进一步地去杂提纯。

表3 蛹虫草蛋白的氨基酸组成及质量分数

3 小结与讨论

通过单因素试验得到冻融辅助碱提蛹虫草蛋白的最优条件，并在此基础上优化结果：蛋白提取料（g）液（mL）比1∶25，-20℃反复冻融3次，pH 12，提取温度40℃，提取时间3 h，蛹虫草蛋白提取率为35.34%。

氨基酸组成测定结果，蛹虫草蛋白氨基酸种类齐全，必需氨基酸占氨基酸总量的42.60%，具有较好的营养价值。其中谷氨酸、天冬氨酸、亮氨酸含量丰富，三者均属于呈味氨基酸，这一结果与菇类鲜美的风味相符。谷氨酸参与神经元的发育，突触的形成、维持和可塑性变化，影响学习与记忆等高级认知功能[11]。天冬氨酸能改善心肌收缩功能，减少耗氧量，在冠状动脉循环障碍缺氧时，保护心肌；同时也参与鸟氨酸循环，能促进氧和二氧化碳生成尿素，降低血液中氮和二氧化碳的量，增强肝脏功能，消除疲劳[12]。亮氨酸可通过促进胰岛素分泌来降低机体的血糖含量，对高原记忆损伤有改善作用[13-14]。可见蛹虫草蛋白还具有一定的保健价值，是一种优质蛋白，可作为一种新型的蛋白资源应用于健康食品的研制与开发。