野生树舌灵芝菌株的分子鉴定

兰玉菲 孔 怡唐丽娜 李秀梅

（泰安市农业科学研究院，山东泰安271000）

树舌灵芝（Ganoderma applanatum）隶属于灵芝属（Ganoderma），为我国传统的药用真菌。树舌灵芝性平、味苦，具有调节机体免疫力、抗肿瘤、抑菌消炎等多种功效，且无任何毒性，临床多用于治疗乙型肝炎、食道癌、肺结核、神经衰弱等[1-4]。

2009年以来，笔者从山东省泰安市及其周边地区采集野生树舌灵芝，用组织分离法分离并纯化，3次纯化后获得纯培养，并用分子生物学手段获得ITS序列并构建系统进化树，明确了分类地位，为进一步驯化栽培和育种提供遗传背景清晰的种质资源。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

供试菌株均由笔者从泰安市、曲阜市等采集的野生树舌灵芝子实体分离纯化所得，保存于泰安市农业科学研究院食用菌研究所。

1.2 主要试剂与仪器

真菌总DNA提取试剂盒（E.Z.N.A.®Fungal DNA Kit）、2×EasyTaq PCR SuperMix等购自北京全式金生物技术有限公司；常规试剂为进口分装或国产分析纯试剂。My Cycle PCR仪，美国伯乐仪器公司。

1.3 培养基

PDA加富培养基：配方参照文献[5]。

1.4 组织分离和培养

参照《植病研究方法》[6]，将采集的野生树舌灵芝子实体生长点表面用70%酒精擦洗后，用解剖刀切取5 mm2组织块，接入PDA加富培养基中，置于25℃黑暗培养。待菌丝萌发后，3次纯化培养获得菌丝纯培养。

1.5 菌丝体制备及DNA的提取

切取PDA加富斜面培养基上保存的5 mm2菌株纯培养，将其接种于PDA加富平板培养基中央，25℃黑暗培养5~7 d，待菌丝长至平板边缘，刮取菌丝体（用于基因组DNA的提取）。

利用DNA提取试剂盒提取真菌总DNA。取200 mg新鲜菌丝体，于液氮中研磨成粉末转移到2 mL离心管中，加入600μL Buffer FG1，混匀后65℃保温10 min，其间轻柔搅动2次；之后加入140μL Buffer FG2混匀，≥10 000g离心10 min；小心吸取上清，加入0.7倍体积的异丙醇混匀，10 000g，离心2 min；倒掉上清液并排出离心管中的残留液体，加入300μL含有RNase的ddH2O重悬沉淀，加入150μL Buffer FG3和300μL无水乙醇混匀；将混合液加入HiBind DNA柱中，10 000g离心1 min，加700μL DNA Wash Buffer，10 000g，离心1 min，漂洗2次；将柱子移至干净的1.5 mL离心管上，加入100μL Elution Buffer，室温放置2~3 min，10 000g离心1 min，洗脱DNA，保存备用。

1.6 ITS扩增

采用真菌ITS区域扩增的通用引物ITS1/ITS4进行PCR扩增[7]。PCR反应体系（50μL）：2×EasyTaqPCR SuperMix 25μL，ddH2O 22μL，模板DNA 1μL（约20 ng），正向和反向引物各1μL（0.4 nmol/L）。PCR反应程序：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，57℃退火45 s，72℃延伸1 min，共35个循环；72℃延伸10 min。

1.7 PCR产物测序

PCR结束后，取4μL反应液进行琼脂糖凝胶电泳，将有目的条带的PCR产物送山东省农业科学院生物技术研究中心测序。

1.8 构建系统发育树

将所得DNA序列输入GenBank进行Blast检索，采用Clustalx1.81、DNASTAR、DNAMAN和MEGA 5软件对所得到的核苷酸序列与GenBank中收录分离物的相应序列进行比较和分析，并构建系统进化树。

2 结果与分析

2.1 野生树舌灵芝的采集及分离纯化

采集到野生树舌灵芝10份（表1）。调查发现野生树舌灵芝常生于杨、桦、柳、栎等阔叶树的枯立木、倒木或伐桩上，多年生，属重要的木腐菌，导致木材木质部形成白色腐朽。采用组织分离方法，并在PDA培养基上经过3次纯化后获得纯培养。

表1 供试菌株来源、采集时间及编号

2.2 野生树舌灵芝的形态特征

野生树舌灵芝子实体大，无柄；菌盖半圆形，基部常下延，有同心环纹棱及大小不等的瘤状突起，边缘薄或圆钝，无油漆样光泽（图1）；菌肉棕褐色至深褐色，有轮纹，无黑色壳质层；菌管褐色，有白色菌丝填充，一层至多层，孔面污白色或淡灰褐色，老后褐色至深褐色，管口近圆形。孢子卵圆形，一端有截头，壁双层，外壁光滑，无色，内壁有刺状突起，褐色，大小为（6.5~9.5）μm×（5~6.5）μm（图2）。

图1 部分野生树舌灵芝

图2 野生树舌灵芝孢子形态（×40）

2.3 ITS基因的扩增

利用DNA提取试剂盒提取树舌灵芝菌株的总DNA，用通用引物ITS1/ITS4进行PCR扩增，10个供试菌株均扩增得到长度约为600 bp的目的片段，与预期片段大小一致。

2.4 序列测定与分析

序列测定结果表明，树舌灵芝ITS序列长度为560 bp（GenBank登录号分别为KM249934、KM249935、KM249936、MG657360、MG657361、MG657362、MG657363、MG657364、MG657365、MG657366），其中包括204 bp内转录间隔区1（ITS1）、155 bp 5.8S编码序列、201 bp内转录间隔区2（ITS2）。同源性比对和构建系统进化树发现10个分离物与GenBank中的3个树舌灵芝分离物（DQ424996、DQ425009、JN008873）聚为一簇，ITS核苷酸一致率为99.46%~100%，从分子水平上证明10个分离物为G.applana⁃tum。

图3 基于ITS序列构建的系统进化树

3 小结

泰山市及其周边地区具有丰富的野生树舌灵芝种质资源，但目前尚未对其野生种质资源进行系统研究，且鉴定手段多为形态学描述，尚未开展分子水平鉴定，对其遗传背景了解甚少，严重影响其驯化栽培和产业化开发。笔者采集泰山市及其周边地区野生树舌灵芝，采用组织分离法培养，3次纯化后获得了10个树舌灵芝菌株的纯培养，从分子水平上证明10个分离物为G.applanatum。

研究从分子水平上对泰山市及其周边地区野生树舌灵芝进行了分离鉴定，明确了其分类地位，为育种工作提供遗传背景清晰的野生种质资源，同时为野生树舌灵芝的驯化栽培和产业化开发奠定基础。