一测多评法同时测定金花清感颗粒中6种成分的含量

刘庆焕，张 岩，傅 予，张 婷，王文彤

（天津市医药科学研究所，天津 300020）

金花清感颗粒由金银花、石膏、蜜麻黄、炒苦杏仁、黄芩、连翘、浙贝母、知母、牛蒡子、青蒿、薄荷、甘草组成，具有疏风宣肺、清热解毒之功效［1］，主要用于单纯型流行性感冒轻症，为COVID-19治疗的推荐中成药［2］，通过临床疗效的同步观察，对于轻度及普通型患者疗效确切［3］。

中药制剂均为多组分复杂体系，单一检测指标难以全面准确评价其质量，多指标控制模式已逐步应用于中药制剂的质量控制中，然而传统的多指标评价模式存在对照品数量众多、价格昂贵等不足。一测多评法（quantitative analysis of multi-components by single marker，QAMS）是以样品中某一典型成分为内参物，建立内参物与其他待测成分间的相对校正因子，计算其他待测成分的含量，实现多种成分同时测定的同时，降低了检测成本［4-5］。目前，关于金花清感颗粒的研究多集中在药理作用、临床观察等方面［3，6-8］，而对其质量评价方面的研究未见文献报道。本研究以黄芩苷为内参物，建立同时测定金花清感颗粒中黄芩苷、绿原酸、芒果苷、牛蒡苷、汉黄芩苷和甘草酸铵含量的一测多评方法，以期为金花清感颗粒的质量控制提供参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器Agilent 1260型高效液相色谱仪；岛津LC-20AT高效液相色谱仪；色谱柱为Agilent Eclipse XDB-C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Kromasil C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；AB135-S型十万分之一电子分析天平（梅特勒-托利多公司）；KQ-520B型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

1.2 试药 乙腈、甲醇（色谱纯，Sigma科技有限公司）；甲醇、乙醇、磷酸（分析纯，天津市化学试剂供销公司）；绿原酸对照品（批号110753-201716，质量分数99.3%）、黄芩苷对照品（批号110715-201318，质量分数93.3%）、甘草酸铵对照品（批号110731-201720，质量分数97.7%）购于中国食品药品检定研究院；芒果苷对照品（MUST-18040123，质量分数98.2%）、牛蒡苷对照品（批号MUST-20041510，质量分数98.8%）购于成都曼斯特生物有限公司；汉黄芩苷对照品（批号19101501，质量分数99.5%）购于成都康邦生物科技有限公司；金花清感颗粒［规格：5 g/袋，批号分别为20200224、20200122、20200116，聚协昌（北京）药业有限公司］；水为娃哈哈纯净水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱为Agilent Eclipse XDB-C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B），按表1进行梯度洗脱；柱温25℃；体积流量1.0 ml/min；进样量10 μl；检测波长：0～9 min，327 nm（绿原酸）；9～20 min，254 nm（芒果苷）；20～54 min，277 nm（黄芩苷、牛蒡苷、汉黄芩苷）；53～75 min，254 nm（甘草酸铵）。理论塔半数按黄芩苷峰计算不低于6 000。

表1 梯度洗脱程序

2.2 溶液的制备

2.2.1 混合对照品溶液的制备 取绿原酸、芒果苷、黄芩苷、牛蒡苷、汉黄芩苷和甘草酸铵6种对照品适量，精密称定，置于25 ml棕色量瓶中，加70%甲醇制成每1 ml含绿原酸49.8 μg、芒果苷20.5 μg、黄芩苷228.4 μg、牛蒡苷410.2 μg、汉黄芩苷74.0 μg和甘草酸铵49.3 μg的混合对照品储备液。精密量取混合对照品储备液5 ml，置于10 ml棕色量瓶中，加入70%甲醇振摇后定容至刻度，摇匀，即得混合对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液的制备 取供试品适量，研细，取约0.2 g，精密称定，置于50 ml具塞锥形瓶中，精密加入70%甲醇20 ml，密塞，称定重量，超声处理（功率250 W，频率40 kHz）30 min，放冷，再称定重量，用70%甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液过0.45 μm微孔滤膜，即得。

2.3 方法学考查

2.3.1 系统适用性试验 精密吸取“2.2”项下混合对照品溶液、供试品溶液及空白溶剂，按“2.1”项下色谱条件测定，见图1。供试品色谱中在与混合对照品色谱中绿原酸、芒果苷、黄芩苷、牛蒡苷、汉黄芩苷及甘草酸铵相应位置位上均有色谱峰出现，且色谱峰之间的分离度均大于1.5，理论塔板数均大于7 000，满足含量测定的要求。

图1 混合对照品（A）供试品（B）空白溶液（C）HPLC图

2.3.2线性关系考查 取“2.2.1”项下混合对照品储备溶液1、2.5、5、7.5和10 ml置于10 ml量瓶中，加入70%甲醇定容至刻度，摇匀，即得系列浓度对照品溶液。分别吸取10 μl注入液相色谱仪，按“2.1”项下色谱条件测定，以对照品浓度（X）为横坐标，峰面积（Y）为纵坐标，绘制标准曲线，得到各待测成分的回归方程及线性范围见表2。结果表明各成分在各自的浓度范围内线性关系良好。

表2 金花清感颗粒6种成分线性关系考查结果

2.3.3 精密度试验 取“2.2.1”项下混合对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件连续进样6次，记录色谱图。计算绿原酸、芒果苷、黄芩苷、牛蒡苷、汉黄芩苷及甘草酸铵峰面积的RSD值分别为0.35%、1.41%、0.65%、0.18%、1.13%和1.07%，表明仪器精密度良好。

2.3.4 稳定性试验 取金花清感颗粒样品（批号20200122），按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，分别于配制后0、3、6、9、12和24 h按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱图。计算绿原酸、芒果苷、黄芩苷、牛蒡苷、汉黄芩苷及甘草酸铵含量的RSD值分别为0.90%、2.08%、0.36%、0.52%、0.14%和0.69%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.3.5 重复性试验 取同一批号金花清感颗粒样品（批号20200122）6份，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱图。计算绿原酸、芒果苷、黄芩苷、牛蒡苷、汉黄芩苷及甘草酸铵含量的RSD值分别0.90%、0.91%、0.17%、0.26%、0.18%和0.08%，表明该方法的重复性良好。

2.3.6 加样回收率试验 取已知6种成分含量的金花清感颗粒样品（批号20200122）约0.1 g，共6份，精密称定，分别按对照品加入量与供试品中待测成分含量的比为1∶1加入绿原酸、芒果苷、黄芩苷、牛蒡苷、汉黄芩苷及甘草酸铵对照品，按照“2.2.2”项下方法制备加样回收供试品，按“2.1”项下色谱条件进样测定，计算加样回收率及RSD。结果绿原酸、芒果苷、黄芩苷、牛蒡苷、汉黄芩苷及甘草酸铵的加样回收率分别为98.00%、101.07%、97.69%、96.92%、96.79%和102.11%，RSD值分别为1.53%、1.78%、1.37%、1.62%、1.68%和1.67%，表明该方法的准确度良好。结果见表3-8。

表3 绿原酸加样回收率试验结果（n=6）

表4 芒果苷加样回收率试验结果（n=6）

表5 黄芩苷加样回收率试验结果（n=6）

表6 牛蒡苷加样回收率试验结果（n=6）

表7 汉黄芩苷加样回收率试验结果（n=6）

表8 甘草酸铵加样回收率试验结果（n=6）

2.4 一测多评法

2.4.1 相对校正因子 取“2.3.2”项下系列对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样测定，以黄芩苷为内参物，按公式fsi=fs/fi=（As/Cs）/（Ai/Ci）计算相对校正因子，式中As为内参物对照品s峰面积，Cs为内参物对照品s浓度，Ai为某待测成分对照品i峰面积；Ci为某待测成分对照品i浓度［4］。结果见表9。

2.4.2 耐用性考查 取“2.2.1”项下混合对照品溶液，分别考查不同型号色谱仪和不同型号色谱柱对相对校正因子的影响。结果表明不同高效液相色谱仪及色谱柱对相对校正因子无显著影响（RSD＜3%），见表10。

表10 不同仪器和不同色谱柱待测成分的相对校正因子

2.4.3 色谱峰定位 以内参物黄芩苷色谱峰为基准峰，采用相对保留时间值法对待测目标成分色谱峰进行定位，分别计算待测成分绿原酸、芒果苷、牛蒡苷、汉黄芩苷和甘草酸铵的相对保留时间（RRT）。计算公式：r=tRi/tRs，tRi为待测物i的保留时间，tRs为内参物s的保留时间。考查各待测成分RRT在不同高效液相色谱仪和色谱柱中的重现性。结果表明各待测成分RRT波动较小（RSD＜3%），表明用相对保留时间法对色谱峰定位是可行的，见表11。

表11 不同仪器和不同色谱柱待测成分的相对保留时间

2.4.4 样品含量测定 取3批金花清感颗粒按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”色谱条件进样测定，分别采用外标法和一测多评法计算样品中绿原酸、芒果苷、黄芩苷、牛蒡苷、汉黄芩苷及甘草酸铵的含量，结果见表12。将2种方法计算结果经相关系数分析，结果2种方法之间的相关系数均大于0.999 9，2种方法计算得含量结果基本一致，t检验结果表明P＞0.05，表明2种方法计算结果无显著性差异。

表12 金花清感颗粒6种成分含量测定结果

3 讨论

3.1 指标成分及内参物的选择 根据处方组成，通过查阅药典及文献，本文对金花清感颗粒中可能含有的成分的麻黄碱、苦杏仁苷、绿原酸、木犀草苷、芒果苷、连翘酯苷A、连翘苷、黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素、贝母素甲、贝母素乙、甘草苷及甘草酸铵等成分进行了考查和筛选。根据各指标的峰型、分离度、响应值及在样品中的含量等为评价指标，最终选择了其中含量和响应值均较高且具有一定代表性的6个指标成分进行后续测定。其中，黄芩苷在6各成分中含量最高，出峰时间位于色谱图中位，在谱图中最易识别，且黄芩苷稳定易得，故选择黄芩苷为内参物。

3.2 色谱条件的优化 本文考查了甲醇-水、甲醇-0.1%甲酸水溶液、乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸水溶液、乙腈-0.1%磷酸水溶液等不同洗脱系统，当流动相为乙腈-0.1%磷酸水溶液时，各峰峰形、分离度以及色谱图基线平稳情况均较好。紫外扫描发现6种成分的吸收波长存在较大差异，单一波长下难以同时检测。故采用254 nm（检测芒果苷、甘草酸铵）、277 nm（检测黄芩苷、牛蒡苷、汉黄芩苷）和327 nm（检测绿原酸）3个波长进行检测。

3.3 供试品溶液的制备方法考查 比较了不同提取方式（超声和回流）、不同溶剂（乙醇、30%甲醇、40%甲醇、50%甲醇、70%甲醇和甲醇）、不同提取时间（10、20、30、40和60 min）以及溶剂量（10、20、30、40和50 ml）对色谱峰响应值的影响，最终确定了供试品溶液的制备方法。

综上所述，本文建立了一测多评法同时测定金花清感颗粒中6种成分绿原酸、芒果苷、黄芩苷、牛蒡苷、汉黄芩苷和甘草酸铵的含量，与外标法所测结果无明显差异，该方法简便、重复性好，可为金花清感颗粒的质量控制提供参考，同时可降低多组分质量控制的检测成本。

1北京市中医管理局.北京中医药科学防治甲型H1N1流感—“金花清感方”新药研发纪实［J］.北京中医药，2009，28（12）：981.