HPLC法同时测定清肺抑火片中盐酸小檗碱、大黄素和大黄酚的含量

王洋洋，佟若菲，孙燕燕

（天津市儿童医院，天津 300400）

清肺抑火片收载于《国家食品药品监督管理总局国家药品标准》WS3-B-0418-90-1中，由黄柏、大黄、黄芩等成分组成，具有清肺止嗽、降火生津功效，临床主要用于咳嗽、发热、便秘等症状。黄柏有效成分为盐酸小檗碱，大黄有效成分为大黄素和大黄酚。本研究采用双波长法同时测定该制剂中黄柏和大黄所含3个组分的含量，该方法专属性强，操作简单，可有效控制该制剂的质量［1］。

1 仪器与试药

1.1 仪器 岛津LC-2010AHT高效液相色谱仪，LC solution工作站。色谱柱：Agilent C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；梅特勒AB265-S电子天平；岛津UV2600紫外-可见分光光度计。

1.2 试药 乙腈（色谱纯，霍尼韦尔有限公司）、甲醇（分析纯，天津市鑫铂特化工有限公司）、磷酸（分析纯，天津市风船化学试剂科技有限公司）、水为纯化水。盐酸小檗碱对照品（中国食品药品检定研究院，批号110713-201814，含量86.7%），大黄素对照品（中国食品药品检定研究院，批号110756-201512，含量98.7%），大黄酚对照品（中国食品药品检定研究院，批号110796-201621，含量99.2%）。清肺抑火片（天津中新药业集团股份有限公司隆顺榕制药厂，批号200024、200034、200044；规格：0.61 g/片）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 采用Agilent C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色谱柱，流动相A为乙腈，流动相B为0.2%磷酸溶液，按表1的时间程序进行洗脱；柱温为35℃，进样量20 μl，体积流量为1.0 ml/min。理论板数按大黄素峰计算应不低于2 500。设定345 nm为盐酸小檗碱的检测波长，254 nm为大黄素和大黄酚的检测波长。

表1 梯度洗脱程序

2.2溶液的制备

2.2.1 对照品溶液制备 精密称取盐酸小檗碱对照品15.34 mg加甲醇溶解至20 ml量瓶中，称取大黄素对照品12.51 mg加甲醇溶解并定容至100 ml量瓶中，称取大黄酚对照品12.55 mg加甲醇溶解并定容至50 ml量瓶中，作为对照品储备液。分别取上述储备液用甲醇溶解并稀释制成每1 ml含盐酸小檗碱约13.3 μg、大黄素约2.5 μg、大黄酚约5.0 μg的溶液，摇匀，即得混合对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液制备 取本品细粉约0.3 g，精密称定，置100 ml三角瓶中，精密加入甲醇50 ml并称定重量，超声处理（功率240 W，频率40 kHz）30 min，冷却至室温后用甲醇补足减失重量，摇匀即得供试品溶液。

2.2.3 阴性样品溶液制备 按处方分别称取缺少黄柏、大黄的药材适量，按供试品溶液制备方法制成阴性样品溶液。

2.3 系统适用性试验 以345 nm和254 nm为检测波长，对上述溶液进样分析，结果见图1-2。供试品溶液主峰的保留时间与对照品溶液主峰保留时间一致，阴性样品无干扰。

图1 对照品（A）供试品（B）阴性样品（C）HPLC色谱图（345 nm）

图2 对照品（A）供试品（B）阴性样品（C）HPLC色谱图（254 nm）

2.4 标准曲线的制备 分别取对照品储备液，加甲醇制成每1 ml中分别含盐酸小檗碱3.32～33.25 μg、大黄素0.61～6.13 μg、大黄酚1.25～12.45 μg的混合对照溶液。分别进样测定峰面积，以对照品浓度为横坐标（X），以峰面积值为纵坐标（Y）进行线性回归，求得盐酸小檗碱回归方程：Y=87 665X＋9 778.9（r=0.999 9，n=5）；大黄素回归方程Y=93 859X-2 602.3（r=0.999 9，n=5）；大黄酚回归方程Y=101 091X-4 138.4（r=0.999 9，n=5）。结果表明，盐酸小檗碱在3.32～33.25 μg/ml、大黄素在0.61～6.13 μg/ml、大黄酚在1.25～12.45 μg/ml范围内呈良好线性关系。

2.5 精密度试验 按“2.1”项下色谱条件，取混合对照品溶液进样6次。测得盐酸小檗碱峰面积RSD为0.5%，大黄素RSD为0.4%，大黄酚RSD为0.4%，结果表明仪器精密度良好。

2.6 重现性试验 取同一批清肺抑火片（批号200034）6份分别制备供试液，按“2.1”项下色谱条件进样测定。结果每片样品中盐酸小檗碱平均含量为0.920 mg，RSD为0.9%；大黄素平均含量为0.250 mg，RSD为0.8%；大黄酚平均含量为0.540 mg，RSD为0.8%。表明此方法重现性良好。

2.7稳定性试验 取同一供试品溶液，分别于0、2、4、6、8和10 h进样测定。测得盐酸小檗碱峰面积RSD为0.8%，大黄素RSD为0.7%，大黄酚RSD为0.7%，表明供试品溶液在10 h内性质稳定。

2.8 回收率试验 分别精密量取对照品储备液各适量，加甲醇制成浓度为含盐酸小檗碱0.079 8 mg/ml、大黄素0.024 5 mg/ml、大黄酚0.049 8 mg/ml的混合对照品溶液；另取9份已知含量的样品（批号200034），每份约0.15 g，精密称定，分别精密加入上述混合对照品溶液2.4、3.0和3.6 ml各3份，再加甲醇分别稀释至50 ml，进样分析。测得盐酸小檗碱平均回收率为98.87%，RSD为1.46%；大黄酚平均回收率98.66%，RSD为1.33%；大黄素平均回收率100.53%，RSD为1.72%。说明此方法回收率符合要求。结果见表2-4。

表2 盐酸小檗碱回收率试验测定结果（n＝9）

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2.9 样品测定 取清肺抑火片3批，分别制备供试品溶液，并进行测定，结果见表5。

表4 大黄素回收率试验测定结果（n＝9）

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3 讨论

3.1 检测波长的选择参考《中国药典》2015年版一部［2］黄柏及大黄含量测定项下检测波长，经紫外光谱扫描结果得知，大黄素和大黄酚最大吸收波长为254 nm，盐酸小檗碱最大吸收波长为345 nm，为提高检测灵敏度，故本试验选用双波长法进行测定。

3.2 流动相的确定经查阅文献可知［3-6］，0.2%磷酸溶液-乙腈适用于盐酸小檗碱、大黄素和大黄酚的检测。本试验考查了不同比例的0.2%磷酸溶液-乙腈流动相系统，梯度洗脱，结果显示按照本试验中的梯度可将各目标成分有效分离。

3.3 提取方法的确定本次试验分别采用加热回流法和超声法分别以50%、70%和纯甲醇作为提取溶剂进行提取。结果表明，以纯甲醇为提取溶剂，采用超声法提取30 min，可将主成分提取完全。