HPLC法测定妇康宝口服液中阿魏酸的含量

车 爽，周 军，曲 佳

（天津市药品检验研究院，天津 300000）

妇康宝口服液由熟地黄、川芎、白芍、艾叶、当归、甘草、阿胶共七味药组成，该药出自《金匮要略》卷下的经典名方“芎归胶艾汤”。当归、艾叶、川芎提取挥发油，药渣与白芍、熟地黄、甘草加水煎煮2次，第1次3 h，第2次2 h，合并煎液，静置18～24 h，滤过，滤液浓缩至适量；另取红糖404 g制成糖浆，阿胶加水加热溶化，分别加入上述溶液中，加热搅拌，放冷，加入上述挥发油及适量的水，混匀，制成1 000 ml，灌装，即得。该品种具有补血调经，止血安胎的功效。主要用于治疗失血过多，面色萎黄，月经不调，小腹冷痛，胎漏胎动，痔漏下血等症［1］。妇康宝口服液方中重用川芎、当归，取其川芎活血行气开郁，当归补血活血调经之力［2-3］。川芎、当归中所含阿魏酸是用以衡量二者质量的有效成分之一。虽然阿魏酸在中药材中分布较为广泛，但经科学研究确实发现了许多阿魏酸及其衍生物的药理作用和生物活性［4-5］。因此，测定处方中阿魏酸的含量，对该品种的质量评价具有积极的意义。本试验在考量制法工艺及中医理论的基础上，建立了以高效液相色谱法测定方中具有活血化瘀，调经止痛作用的当归、川芎两味药中阿魏酸含量的方法，并测定了来自4家企业的54批次样品中阿魏酸的含量。

1 仪器与试剂

1.1 仪器Shimadzu LC-20AD高效液相色谱仪；DAD检测器。

1.2 试剂 阿魏酸（购自中国食品药品检定研究院，批号110773-201614，99.0 %，供含量测定用）；甲醇（色谱纯，默克股份有限公司）；乙腈（色谱纯，默克股份有限公司）；磷酸（分析纯，天津市赢达稀贵化学试剂厂）；乙醇、乙醚（分析纯，天津市康科德科技有限公司）；水为Milli-Q超纯水。样品为市售品，均来自于2019年国家药品评价性抽验项目所抽验样品。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 采用phenomenex Luna C18（2）100Å（250 mm×4.6 mm，5 μm）色谱柱；以乙腈为流动相A，以0.1 %磷酸溶液为流动相B，按表1进行梯度洗脱；检测波长为321 nm；柱温35℃，流速：1.0 ml/min；进样量10 μl。理论板数按阿魏酸峰计算应不低于5 000。

表1 梯度洗脱程序

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液的制备 取阿魏酸对照品适量，精密称定，加70 %甲醇制成每1 ml含5 μg的溶液。

2.2.2 供试品溶液的制备 取本品10 g，精密称定，置50 ml量瓶中，加乙醇至刻度，振摇5 min，离心，精密量取上清液25 ml，蒸干，用水20 ml分次洗涤蒸发皿，转移至分液漏斗中，用乙醚振摇提取3次，每次20 ml，合并乙醚液，低温蒸干，残渣加甲醇溶解并转移至10 ml量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，0.45 μm滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.2.3 阴性样品溶液的制备 按处方配比，取除当归、川芎外的各味药材，按工艺制备成阴性样品，再按“2.2.2”项下供试品溶液制备方法制成阴性样品溶液。

2.3 系统适应性试验 分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液和阴性样品溶液各10 μl，按“2.1”项下条件进样测定。结果表明阴性样品溶液对测定无干扰。见图1。

图1 对照品（A）供试品（B）阴性样品（C）HPLC色谱图

2.4 标准曲线的制备 取阿魏酸对照品适量，精密称定，加70%甲醇分别制成每1 ml各含1.589 0、2.648 2、5.296 5、7.944 8和10.593 0 μg的溶液，精密吸取上述溶液各10 μl，分别注入液相色谱仪，按“2.1”项下色谱条件分析，分别测定峰面积，以对照品浓度（μg/ml）为横坐标，以峰面积为纵坐标，求得回归方程：Y=49 341.66X＋1 211.02（r=1.000 0）。结果表明阿魏酸在1.589 0～10.593 0 μg/ml浓度范围内与峰面积呈良好的线性关系。

2.5 精密度考查 取同一批号妇康宝口服液（批号180101）10 g，精密称定，依“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件连续进样分析6次。阿魏酸峰面积的RSD为1.7%。

2.6 重复性考查 取同一批号妇康宝口服液（批号180101）10 g，精密称定，共6份，依“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样分析，测定每份样品中阿魏酸的含量。结果阿魏酸平均含量为12.422 7 μg/g，RSD为1.1 %，重复性良好。

2.7 稳定性考查 取同一批号妇康宝口服液（批号180101）10 g，精密称定，依“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样分析，分别在0、4、12及24 h测定样品中阿魏酸的峰面积，结果峰面积值的RSD为1.8 %，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.8 加样回收率试验 取“2.6”项下已测知阿魏酸含量的妇康宝口服液（批号180101）5 g，精密称定，共6份，分别精密加入浓度为0.844 47 μg/ml的对照品溶液50 ml。依“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样分析，计算回收率。结果平均回收率为97.13 %，RSD为2.0 %。见表2。

表2 加样回收试验结果（n=6）

2.9 样品测定及结果统计分析 依“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样分析，测定54批次样品中阿魏酸的含量，结果见表3和表4。

表3 样品含量测定结果（n=2）

3 讨论

3.1 提取方法的考查 本研究采用乙醇和1 %碳酸氢钠为提取溶剂，结果表明使用乙醇能够提取完全；采用振摇和超声的方式提取，结果表明两种方法提取效率相当，但振摇提取时间短，最终选择振摇方式提取；分别考查了用乙醚和乙酸乙酯萃取，结果两者提取效率相当，最终选择用乙醚提取；进一步考查了不同萃取次数（3、4、5次），结果萃取3次即可提取完全；最后考查了不同溶剂倍数的影响（10 g→50 ml、2 g→50 ml），结果取10 g样品加入50 ml溶剂提取含量稍高。

3.2 色谱条件的考查 参考大量文献［6-8］及《中国药典》2015年版一部有关该成分含量的测定方法对流动相进行摸索考查，分别采用甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.1 %磷酸、乙腈-0.1 %冰醋酸、甲醇-1 %醋酸等组分按不同比例进样，结果显示采用乙腈-0.1 %磷酸溶液梯度洗脱方式，目标峰分离效果最好且峰形对称，无其他成分干扰。参照《中国药典》2015年版一部当归、川芎含量测定项下中阿魏酸的有关要求，结合DAD检测器实际测定的最大吸收波长，最终选取321 nm作为阿魏酸的检测波长，结果表明测定时基线平稳，峰形良好，无杂质峰干扰。

3.3 含量测定结果分析 应用该方法对4家企业54批次24个不同批号的妇康宝口服液样品进行测定，由结果可见，企业2、3之间的平均值较为接近。企业1、和企业4平均值与之差异较大，表明不同企业之间产品质量存在差异，各企业在生产工艺或者原料药材质量方面把握程度不一。企业1、2、4测定结果最高值和最低值相差较大，说明在生产过程中存在较为严重的不稳定因素。因此，建议相关企业积极提升原料药材的质量；另外，应考查提取工艺参数对阿魏酸稳定性的影响，并规范生产工艺进行生产。分析含量测定结果差异大的原因可能有以下几个方面：①生产中使用的药材质量较差，有效成分含量较低；②未严格按处方量进行投料；③生产工艺参数不合理，未经考查验证，药材中的有效成分未被完全提取出来或被破坏。