新生儿甲基丙二酸血症的筛查与基因突变分析

夏飞燕 尹文东 韦洪伟 孙永叶

甲基丙二酸血症（methylmalonic acidemia，MMA）作为一种有机酸血症，可导致神经、消化以及泌尿等多系统损伤，大多伴有染色体隐性遗传，若救治不及时很容易导致患者死亡或残疾[1]。MMA发病原因复杂，甲基丙二酰辅酶A变位酶（methylmalonyl—CoA mutase，MCM）或其辅酶钴铵素代谢缺陷是其主要发病机制。MMA临床表现多样，在任何年龄段均可发病，且临床症状无特异性，很容易被误诊或漏诊，通常根据生化或基因等检查对其进行确诊[2]。串联质谱技术，可对氨基酸代谢病等多种遗传代谢病进行筛查，能够一次筛查多种疾病，将其应用于MMA的筛查，能够有效提高临床对MMA患儿的诊断效果[3]。本研究旨在探讨液相色谱串联质谱筛查MMA的效果和MMA患儿基因突变情况，以便为临床诊治MMA提供重要依据，具体情况如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

以2014年8月—2019年12月期间，临沂市妇幼保健院新生儿疾病筛查中心的150 583例新生儿为本次研究对象，其中男性82 675例，女性67 908例，均为活产新生儿，均接受遗传代谢病筛查，新生儿家属均知晓本研究并签署同意书。

1.2 方法

1.2.1 串联质谱技术 （1）液相色谱检验：采集新生儿出生3~7天后的足底血，将其滴注到采血透纸上，制成干血滤纸片后，送至新生儿疾病筛查中心对其进行检验。使用美国Waters公司生产的Xevo TQD型液相色谱串联质谱仪，对样本中的氨基酸、酰基肉碱等情况进行分析。其中血游离肉碱的参考范围为10~50μmol/L，乙酰肉碱（C2）参考值为8~40，乙酰肉碱（C2），丙酰肉碱（C3）参考值为0.2~4.3μmol/L，C3/C2比值的正常范围为0.03~0.20。（2）气相色谱检验：对于筛查出的MMA患儿，均采集尿液，经甲基硅烷化衍生等多种处理后，使用日本岛津公司公司生产的QP2010型气相色谱质谱仪，采用半定量法对其进行检验，尿液中甲基丙二酸的正常参考范围为0.2~3.6，甲基枸橼酸正常范围为0~1.0。

1.2.2 基因突变分析 采集MMA患儿2 mL外后静脉血，将其置于抗凝管内，使用Blood DNA mini kit进行基因组DNA提取，测定其浓度后保存在-20℃条件下备用，采用常规Sanger测序技术对其阳性突变位点进行验证，并检测患儿父母的基因组DNA相应阳性位点。

1.2.3 临床诊断及分型 对于初筛阳性者将其召回复查，若复查结果仍显示为阳性，则对其进行尿气相色谱质谱检验，并对其进行实验室检查、基因突变等检查，以进一步明确患儿病情。诊断依据：（1）伴有嗜睡、喂养困难、生长发育落后、抽搐、肌张力低下和肝肾功能等生化检查异常；（2）液相色谱检测显示血C3、C3/C2升高，游离肉碱水平降低；（3）气相色谱检测显示尿甲基丙二酸/甲基枸橼酸水平升高；（4）排除营养因素所引发的继发性MMA。分型：根据其同型半胱氨酸水平（homocystine，Hcy）分为单纯型MMA（Hcy正常）和合并型MMA（Hcy升高）。根据发病年龄划分，将发病年龄在1岁及以下划分为早发型，发病年龄大于1岁为晚发型。根据维生素B12负荷试验分为维生素B12有效型和无效型。

1.2.4 临床治疗及随访 急性期以纠正酸中毒、补液为主，静脉滴注左旋肉碱，使用剂量为100 mg/（kg·d）；肌内注射维生素B12，1mg/d，连续治疗5天。高氨血症患儿可口服25 mg/（kg·d）的精氨酸。维持期维生素B12有效患儿，肌内注射维生素B12，1 mg/次，每周3次；口服左旋肉碱50 mg/（kg·d）；亚叶酸钙，15 mg/（kg·d）；甜菜碱，200 mg/（kg·d）。维生素B12无效患儿以饮食控制为主，控制总蛋白摄入量为2~4 g/（kg·d），适当补充矿物质、维生素等。随访6个月观察患儿病情控制情况，使用Gesell婴幼儿发育量表评估患儿智能发育情况，以各能区评分在75分以上为智能发育正常，否则为异常。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 MMA检出及生化检验情况

本研究筛查的150 583例新生儿中，诊断为MMA的患儿共18例，其中男性患儿10例，女性患儿8例，患儿确诊时日龄为18~47天，平均（30.45±4.82）天。根据Hcy水平分类为单纯型MMA 5例，均为维生素B12无效型，另外13例为合并型MMA，均为维生素B12有效型，且均接受正规治疗，患儿治疗后各生化指标与治疗前比较均明显改善（P＜0.05）。详见下表1。

表1 合并型MMA患儿治疗前后生化检测结果（±s）

表1 合并型MMA患儿治疗前后生化检测结果（±s）

时间 血C3（μmol/L） 血C3/C2Hcy（μmol/L） 尿甲基丙二酸 尿甲基枸橼酸治疗前7.01±1.860.82±0.3598.46±35.7968.72±15.436.98±2.45治疗后3.42±1.250.19±0.0532.58±14.265.65±2.381.01±0.57 t值5.7766.4256.16614.5658.557 P值0.0000.0000.0000.0000.000

2.2 MMA患儿基因突变分析

本研究诊断出的18例MMA患儿中，有11例采用高通量测序实时基因突变检测，其中2例为单纯型MMA，9例为合并型MMA。其中8例检测出MMACHC基因突变，1例检测出HCFC1基因突变，还有1例检测出MMACHC和1例HCFC1基因突变，共检测出11种基因突变位点，其中未见报道位点3种（C.4439C＞T、C.4537A＞T、C.239A＞G），已报道位点8种（C.666C＞A、 C.440_441del、C.482G＞A、C.80A＞G、C.599G＞A、C.394C＞T、C.656_658delAGA、C.609G＞A），其中C.609G＞A为最为常见的基因突变位点。见表2。

表2 MMA患儿的基因突变检测结果分析

2.3 随访及预后情况

随访6个月，3例单纯型MMA患儿中2例患儿的体格、智能均发育正常，尿甲基丙二酸、甲基枸橼酸均明显下降，但仍未达到正常水平。另外1例随访过程中发现生长发育迟缓，辅以康复训练后各血C3、C3/C2以及尿甲基丙二酸等指标均下降，但仍高于正常范围，3月龄时Gesell婴幼儿发育量表各能区评分为语言61分，适应性66分，精细动作65分，大动作和个人-社交分别为61分和69分。5月龄时突然发病就诊，家属考虑患儿预后差放弃治疗，6例患儿在随访过程中5例生长发育正常，血C3、C3/C2、Hcy、尿甲基丙二酸、甲基枸橼酸等指标均控制良好；1例出现轻度精神运动发育迟缓，血C3、C3/C2等指标均较治疗前下降，但仍高于正常水平。

3 讨论

MMA是一种先天性有机酸血症，可导致多脏器损伤，在新生儿和成人中均可发病[4-6]。我国MMA发病率尚不明确，本研究通过对150 583例新生儿的MMA筛查情况进行分析发现，确诊为MMA患儿18例，发病率为1:8 366。确诊的18例MMA患儿中，有11例接受了高通量测序实时基因突变检测，共检测出了11种基因突变位点，其中未见报道位点3种，已报道位点8种，在这些基因突变位点中以C.609G＞A为最为常见。随着人们对MMACHC认识的深入，越来越多的研究发现，MMACHC基因型与MMA患儿临床表型以及预后具有较大关系[7]。有研究报道，C.609G＞A这一热点突变患儿大多发病较早，且病情重，预后差，该突变可导致色氨酸翻译提前终止，从而导致cblC蛋白功能缺陷[8]。C.656_658delAGA突变也同样会导致上述问题发生。C.482G＞A突变对蛋白功能的影响相对较小，所以临床表型较轻，通常与晚发型MMA有关[9-11]。C.80A＞G突变可导致氨基酸向精氨酸转变，是导致患儿心血管系统受累的主要原因。C.394C＞T突变可产生截短蛋白，导致患儿精神不佳或喂养困难。C.599G＞A可提前终止肽链合成[12]。

总之，在新生儿期应用液相色谱串联质谱技术进行MMA筛查，并结合基因测序分析其基因突变情况，有助于早期发现和干预MMA，从而改善患儿预后。