一起副溶血性弧菌食物中毒的实验室检测分析

邱艺燕 欧秀华

近年来由于交通快速发展， 特别在气温较高的季节如夏秋季， 海产品食用量高的地区， 副溶血性弧菌引起的聚集性食物中毒事件比例逐年上升。副溶血性弧菌是造成我国细菌性食源性疾病事件最常见的致病菌，占全国微生物食源性疾病事件的27.8%[1]。特别是沿海地区，副溶血性弧菌造成的食物中毒比率更高。副溶血性弧菌是一种嗜盐性的革兰阴性弧菌，主要存于海水、海产品， 及盐渍食品中。食用被副溶血性弧菌污染的海产品和其他食品后， 能引起恶心、呕吐、腹泻、腹痛等主要临床症状，病情严重的患者甚至可能会导致死亡，因此尽快查明病原菌并给予及时的对症治疗对于挽救患者的生命具有十分重要的意义。 2018年9月24日7时20分，集美区疾病预防控制中心接到报告，厦门集美区某健身器材有限公司陆续有员工出现腹痛、腹泻和呕吐等症状，我中心接到报告后立即赶往现场进行流行病学调查并采集标本进行检测，调查发现：患者潜伏期6~18个小时，临床症状是先腹泻再呕吐，腹泻以水样泻为主，血常规检查有白细胞增高。截止9月24日13：00共有20人出现类似症状，到就近的医院就诊，经抗生素治疗后都已好转。为进一步核实疫情、查明病原体和波及范围，有效预防和控制类似疫情的发生，集美区疾控中心专业技术人员开展了此次调查，并采集患者的肛拭子和患者进食的剩余食品进行检测，15份肛拭子样本中11份检出副溶血性弧菌（73.3%），15份食品样本中1份食品检出副溶血性弧菌（6.7%），且两者的生物编码一致。现将实验室检测结果分析如下。

1 材料与方法

1.1 送检样品

现场共采集标本30份，其中患者肛拭子15份，可疑食物15份（9月23日中餐食物标本：鸭肉拌黄瓜、炒白菜、西红柿炒蛋、麻婆豆腐、冬瓜蛋汤、米饭、炒豆芽、蚝油鸡肉片；9月23日晚餐食物标本：同安封肉、水煮肉片、咸水鸭、炸里脊肉、凉瓜黄豆龙骨汤、清蒸海鲈鱼、水煮三鲜）。

1.2 材料及仪器

1.2.1 材料 BPW、SC增菌液、TTB增菌液、志贺氏菌增菌肉汤-新生霉素、营养肉汤、肠道菌增菌肉汤、7.5%NaCl肉汤、3%氯化钠碱性蛋白胨水等增菌培养液。TCBS琼脂、BS琼脂、 XLD琼脂、MAC、EMB、血平板琼脂和Baird－Parker培养基等分离培养基。3%氯化钠MR-VP培养基、3%氯化钠赖氨酸脱羧酶试验培养基、3%氯化钠三糖铁琼脂、氧化酶试剂、3%氯化钠溶液、3%氯化钠甘露醇试验培养基、革兰氏染色液、ONPG等生化试剂。增菌液和生化管的生产厂家均是北京陆桥技术股份有限责任公司；配套GN鉴定卡、GP鉴定卡均来自法国梅里埃公司。上述增菌液、培养基、生化管及鉴定卡都在有效期内。

1.2.2 仪器 VITEK 2 Compact全自动生化鉴定仪（Biomerieux，法国）。

1.3 方法

按GB 4789.4-2016[2]；GB 4789.5-2012[3]；GB/T 4789.6-2016[4]；GB 4789.7-2013[5]和GB 4789.10-2016[6]标准，对采集的肛拭子和可疑食品进行沙门氏菌、志贺氏菌、致泻大肠埃希氏菌、副溶血性弧菌检测和金黄色葡萄球菌五种常见微生物致病菌检测。

2 结果

2.1 增菌

肛拭子标本：取肛拭子保存液1 mL，分别加入9 mL缓冲蛋白胨水（BPW）、3%氯化钠碱性蛋白胨水、7.5%氯化钠肉汤、志贺氏菌增菌肉汤-新生霉素、营养肉汤增菌液中；食品标本：无菌称取25 g样品加入225 mL的缓冲蛋白胨水（BPW）、3%氯化钠碱性蛋白胨水、7.5%氯化钠肉汤、志贺氏菌增菌肉汤-新生霉素、营养肉汤增菌液中，用均质器拍击2 min，做成1：10的样本匀液。将志贺氏菌增菌肉汤-新生霉素放42℃生化培养箱培养厌氧培养18 h；将缓冲蛋白胨水（BPW）、3%氯化钠碱性蛋白胨水、7.5%氯化钠肉汤、营养肉汤增菌液放于36℃生化培养箱内培养。36 ℃培养6 h后，取10 μL营养肉汤增菌液接种于30 mL肠道增菌肉汤管内，再将肠道增菌肉汤放到42℃生化培养箱培养18小时进行二次增菌。缓冲蛋白胨水（BPW）、3%氯化钠碱性蛋白胨水、7.5%氯化钠肉汤、营养肉汤增菌液这四种增菌液36 ℃培养18 h后，发现只有3%氯化钠碱性蛋白胨水増菌液较为浑浊，其余增菌液都较为澄清。3%氯化钠碱性蛋白胨水、7.5%氯化钠肉汤这两种增菌液36 ℃培养18 h后即可划板分离；志贺氏菌增菌肉汤-新生于霉素42℃厌氧培养18 h后也即可划板分离。缓冲蛋白胨水（BPW）增菌液跟营养肉汤一样需要二次增菌，具体步骤如下：移取1 mL的缓冲蛋白胨水（BPW），转种于10 mL的TTB内，于42℃培养20 h；同时，另取1 mL缓冲蛋白胨水（BPW），转种于10 mL SC内，于36℃培养20 h。

2.2 分离培养

挑取各增菌液在相应的平板上划板分离培养，TCBS平板36 ℃培养24 h 后，发现有副溶血性弧菌的可疑菌落（表面光滑的圆形半透明的绿色菌落，用接种环轻轻接触下，有种口香糖粘粘的质感，直径约2 mm）。BS琼脂、 XLD琼脂、MAC、EMB、血平板琼脂和Baird－Parker培养基等其它分离培养基平板上未均发现可疑的菌落。

2.3 纯培养

挑取TCBS上的可疑菌落，在 3%氯化钠胰蛋白胨大豆琼脂平板上划板分离培养，36 ℃的生化培养箱培养24 h，再挑取3%氯化钠胰蛋白胨大豆琼脂平板上的单个纯培养菌落做革兰染色及生化检测。

2.4 初步鉴定

革兰染色呈棒状、弧状革兰氏阴性的小杆菌，无芽孢；氧化酶试验阳性；在3%氯化钠三糖铁琼脂中的生化反应为底层分解葡萄糖变黄，斜面不分解乳糖呈红色，无气泡产生，穿刺线呈浑浊生长，有动力；在 6%、8%氯化钠的胰胨水中生长旺盛，在0%、10%氯化钠的胰胨水中微弱生长或不生长。

2.5 确定鉴定

挑取纯培养菌落，配制菌悬液，再用VITEK 2全自动细菌鉴定仪上机做生化鉴定。

2.6 检测结果

15份肛拭子样本中有11份检出副溶血性弧菌（73.3%），生物编码都为：5021611140400262。15份食品样本中有1份可疑食物（蚝油鸡肉片）检出副溶血性弧菌（6.7%），生物编码也为：5021611140400262，食品与肛拭子的生物编码一致。均未检出致泻大肠埃希氏菌、沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌。

3 讨论

根据现场的流行病学调查结果、卫生学调查结果、患者的临床表现和实验室的检测结果，参照WS/T 81-1996《副溶血性弧菌食物中毒诊断标准及处理原则》[7]，判断本次事件是一起因食用被副溶血性弧菌污染的食物（蚝油鸡肉片）引起的食物中毒。副溶血性弧菌具有嗜盐的特性，因此在沿海的海产品中检出率较高，约为30%～40%，尤其是鱼、贝、虾类等海产品带菌率极高[8-10]。沿海地区市民常吃水产品，有的还喜欢生吃蘸酱的海鲜，因此副溶血性弧菌引起的食物中毒是我国沿海地区高发的一种食物中毒[11]。副溶血性弧菌分泌的溶血素起致病作用，即tlh、tdh和trh，分别由tlh、tdh和trh基因编码[12-13]。其中，tdh毒力基因被认为是副溶血性弧菌最主要的毒力因子[14]。

实验结果显示生化鉴定符合副溶血性弧菌的生化特征，且肛拭子与食品（蚝油鸡肉片）的生物编码一致。除了生化检测符合外，还可以做一下补充实验：（1）毒力基因的检测，利用PCR技术检测副溶血性弧菌致热性溶血素基因tdh和TDH类似溶血毒基因 trh 的携带情况，判断是否存在成为大流行株的可能性。（2）多位点序列分型（MLST），通过测序获得相应的等位基因谱，再分析判断其序列型（ST）。MLST 具有良好的分辨力、更高的明确性、重复性等特点，可以为防控副溶血性弧菌食物中毒提供分子的流行病学依据。（3）脉冲场凝胶电泳（PFGE）：是一种分离大分子DNA的方法，脉冲场凝胶电泳可以用来分离大小从10 kb到10 Mb的DNA分子。该技术已广泛应用于对致病菌的分型和溯源，现已成为细菌分型的 “金标准”。本研究前期的研究结果显示VP（副溶血性弧菌）毒力基因检出率较低，加上单位没有配置PCR仪、脉冲场凝胶电泳仪等仪器，因此未对 VP的毒力基因以及VP的分型和溯源做进一步的检测分析。

副溶血性弧菌在水产品中广泛存在[15]，但值得注意的是引起副溶血性弧菌食物中毒的食物并不一定都是海产品,有研究表明，副溶血性弧菌在运输、加工、销售等环节，均可通过接触而交叉污染其他食品[16]。食物制作过程中的交叉污染导致食物中毒事件日益增加[17-18]。熟食制品和肉禽食品、蔬菜等加工过程不规范容易受到污然后加上保存方式不当，夏天气温又高，食用后都有可能发生食物中毒。本次食物中毒事件的发生可能与蚝油鸡肉片加工或者运输过程中受到致病因子污染相关。现场调查时了解到该健身器材公司食堂的A餐厅午餐由湖里区某餐饮配送公司配送，湖里区某餐饮配送公司八点多开始准备食材，快十点开始炒菜，然后一荤两素打到每份快餐盒里，差不多十一点再将这些装好饭菜的快餐盒供载到集美区某健身器材公司，供该健身器材公司的员工就餐，食物跨区运输时间比较长（大约一个小时）食物长时间焖在快餐盒里，有利于细菌的增殖；副溶血性弧菌具有嗜盐怕酸的特点，无盐环境一般不生长，而蚝油鸡肉片中的蚝油含有盐为副溶血性弧菌提供了适宜的生长环境；副溶血弧菌增值一代的时间为10分钟，食物在pH 7.5~8.8，温度25℃～30℃的含盐条件下，放置一定时间即可大量增殖[19]。加上九月份气温较高，这些客观因素都为细菌的大量繁殖提供了有利条件，从而导致本次副溶血性弧菌食物中毒的发生。

综上所述，本次事件是一起因食用被副溶血性弧菌污染的食物（蚝油鸡肉片）引起的食物中毒，副溶血性弧菌引起的食物中毒是我国沿海地区高发的一种食物中毒，副溶血性弧菌在水产品中广泛存在，为了避免食物中毒，预防的作用很关键。具体有以下建议：一、因为副溶血性弧菌具有喜欢盐害怕酸、不耐受高温的特点，建议群众烹调水产品时加适量食醋。二、副溶血性弧菌怕热爱冷，建议广大群众食物要低温保藏，尽量缩短食物运输时间（或者低温运输），在食用食物前，要先将食物烧熟煮透。三、监管机构必须广泛开展食品安全与健康知识宣传活动，增强人们的自我保护意识；加强对餐饮部门的卫生监督，尤其要健全餐饮店的留样制度；提高食品从业人员的食品安全、卫生意识；督促食品从业人员加工过程中生熟食物和器具要分开，避免交叉污染，减少食品安全隐患。 四、另外，副溶血性弧菌引起的食物中毒以夏季和秋季为高发季节，建议相关部门应在夏秋季加强监测，加强食品的卫生监督和加大采样检验，从而降低食源性致病菌感染的风险，避免食源性疾病的发生。