淡豆豉提取物通过调控LncRNA miR155HG/miR-409-3p表达抑制肺癌细胞的增殖、迁移和侵袭

张进召 刘松 潘双 刁鑫 李亚明

(西安医学院第一附属医院(西安医学院全科医学院)呼吸与危重症医学科，陕西 西安 710077)

肺癌是世界上死亡率和发病率非常高的恶性肿瘤，治疗手段有免疫治疗、手术治疗及化疗等，寻找更有效治疗手段是目前医学的重点和难点〔1〕。研究发现中医药在肺癌的治疗中发挥着重要作用〔2〕。淡豆豉是由豆科植物大豆的成熟种子和青蒿、桑叶等经发酵加工而成的制品，其活性成分异黄酮等有抗肿瘤、抗氧化等功效〔3〕。研究发现淡豆豉异黄酮可抑制血管紧张素(Ang)Ⅱ诱导的大鼠血管平滑肌细胞增殖，其机制可能与阻断JAK2/STAT3信号通路的磷酸化有关〔4〕。淡豆豉提取物剂量依赖性抑制乳腺癌细胞增殖，高浓度还可促进细胞凋亡〔5〕。长链非编码RNA(LncRNA)的异常表达与肺癌发生发展、原位侵袭和远处转移密切相关〔6〕，miR155HG是LncRNA的一种，因是miR-155的宿主基因而得名，研究报道miR155HG能通过调控miR-155-5p增强人肺腺癌A549细胞的增殖、迁移和侵袭能力〔7〕。干扰miR155HG通过抑制miR-155-5p和miR-155-3p的产生，抑制细胞增殖、迁移、侵袭和原位神经胶质瘤生长〔8〕。研究发现miR-409-3p可作为肿瘤抑制因子参与调控肿瘤进展〔9〕。miR-409-3p通过靶向血管生成素抑制HT1080细胞增殖、血管形成和转移〔10〕；miR-409-3p在胃癌组织中低表达，上调miR-409-3p表达通过调控靶基因PHF10抑制胃癌细胞增殖并诱导凋亡〔11〕。然而淡豆豉提取物对肺癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响及其机制尚不清楚，本研究旨在探讨淡豆豉提取物对肺癌细胞的增殖、迁移和侵袭的影响及其机制是否与miR155HG/miR-409-3p有关。

1 材料和方法

1.1材料与试剂 肺癌细胞株A549购自中国科学院上海细胞库；RPMI1640培养基购自美国Gibco公司；淡豆豉购自亳州百川药业；RNA提取试剂盒、qPCR试剂盒均购自日本Takara公司；四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法试剂盒、蛋白提取试剂盒均购自上海碧云天生物公司；双荧光素酶报告基因检测试剂盒购自美国Promega公司。

1.2方法

1.2.1淡豆豉提取物的制备 将淡豆豉干燥后粉碎，过10目筛，取30 g粉末置于1 000 ml三角瓶中，依次加入300 ml 70%乙醇，300 ml丙酮，室温超声提取3次，20 min/次，合并提取液并减压浓缩，冷冻真空干燥的粉末提取物。再根据实验所需配制成所需浓度。

1.2.2细胞培养与分组 肺癌细胞A549用RPMI1640培养基常规培养，将A549细胞分为对照组和淡豆豉提取物组；对照组：不添加淡豆豉提取物；淡豆豉提取物组：细胞培养24 h后，吸去原培养液，换成不同浓度的淡豆豉提取物培养液，其浓度分别为100 μg/ml、200 μg/ml、400 μg/ml。将生长至80%的A549细胞用无血清培养基同步化12 h，随后进行转染。将si-NC、si-miR155HG、miR-NC、miR-409-3p转染至A549细胞，记为si-NC组、si-miR155HG组、miR-NC组、miR-409-3p组；将pcDNA、pcDNA-miR155HG转染至A549细胞后再用400 μg/ml的淡豆豉提取物处理，记为淡豆豉提取物+pcDNA组、淡豆豉提取物+pcDNA-miR155HG组。

1.2.3qRT-PCR分析miR-409-3p和miR155HG表达水平 提取总RNA，合成cDNA后按试剂盒说明进行qRT-PCR，相对表达量采用2-△△Ct法计算。

1.2.4Western印迹检测蛋白表达 提取细胞总蛋白，定量后进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，转膜，用封闭液封闭，加入一抗4℃孵育过夜，洗膜加入二抗室温孵育2 h，显影，成像，分析蛋白条带的灰度值，计算蛋白表达水平。

1.2.5MTT比色法测定细胞增殖抑制率 各组细胞培养48 h，每孔加入20 μl的MTT试剂，孵育4 h，加入150 μl的二甲基亚砜，震荡混匀，酶标仪测定490 nm波长处OD值。将对照组细胞抑制率设定为0 %。其余各组细胞抑制率(%)=(1-实验组OD值/对照组OD值)×100%。

1.2.6Transwell检测细胞迁移和侵袭 用无血清培养液重悬各组细胞，取200 μl接种于Transwell上室，培养24 h，弃去培养液，用4%多聚甲醛固定30 min，再加入结晶紫染色，漂洗干燥后用显镜拍照并计数，即为迁移细胞数。侵袭实验用基质胶平铺覆盖Transwell上室，然后同迁移操作。

1.2.7荧光素酶报告实验 构建miR155HG野生型和突变型荧光素酶表达载体，将其分别与miR-409-3p和miR-NC转染到A549细胞，依据说明书要求，检测细胞荧光素酶活性。将pcDNA、pcDNA-miR155HG、si-NC、si-miR155HG分别转染至A549细胞，用 qRT-PCR分析miR-409-3p表达水平。

1.3统计学方法 采用SPSS20.00软件进行t检验、单因素方差分析。

2 结 果

2.1淡豆豉提取物对肺癌A549细胞增殖、迁移侵袭的影响 相较于对照组，不同浓度淡豆豉提取物组A549细胞中细胞周期蛋白(Cyclin)D1、基质金属蛋白酶(MMP)-2、MMP-9蛋白表达水平逐渐降低，p21蛋白表达水平逐渐升高(均P<0.05)；A549细胞的抑制率随着淡豆豉提取物浓度升高而逐渐升高(均P<0.05)；A549细胞迁移和侵袭数量随淡豆豉提取物浓度升高而逐渐减少(均P<0.05)。见图1、图2、表1。

1～4：对照组、淡豆豉提取物100 μg/ml组、淡豆豉提取物200 μg/ml组、淡豆豉提取物400 μg/ml组图1 Western印迹检测增殖、迁移、 侵袭相关蛋白表达

图2 淡豆豉提取物对肺癌A549细胞增殖、迁移、侵袭的影响(结晶紫染色，×200)

表1 淡豆豉提取物对肺癌A549细胞增殖、迁移侵袭的影响

2.2淡豆豉提取物对肺癌A549细胞中miR155HG和miR-409-3p表达的影响 相较于对照组，不同浓度淡豆豉提取物组miR-409-3p表达水平逐渐升高；miR155HG表达水平逐渐降低(均P<0.05)。见表2。

表2 淡豆豉提取物对肺癌A549细胞中miR155HG和 miR-409-3p表达的影响

2.3miR155HG靶向调控miR-409-3p的表达 TargetScan预测到miR155HG与miR-409-3p存在结合位点。见图3。相较于miR-NC与WT-miR155HG组，miR-409-3p与WT-miR155HG组细胞A549的荧光素酶活性显著降低(P<0.05)。见表3。pcDNA-miR155HG组miR-409-3p表达水平(0.36±0.04)显著低于pcDNA组(1.00±0.09，P<0.05)；si-miR155HG组miR-409-3p表达水平(2.34±0.22)显著高于si-NC组(1.01±0.08，P<0.05)。

图3 miR155HG含有与miR-409-3p 互补的核苷酸序列

表3 双荧光素酶报告实验

2.4抑制miR155HG表达对肺癌A549细胞增殖、迁移侵袭的影响 相较于si-NC组，si-miR155HG组CyclinD1、MMP-2、MMP-9、miR155HG表达水平均显著降低，p21蛋白表达水平显著升高(均P=0.000)；A549细胞抑制率显著升高(P=0.000)；细胞迁移和侵袭数量均显著减少(均P=0.000)。见表4、图4。

表4 抑制miR155HG表达对肺癌A549细胞增殖、迁移侵袭的影响

图4 抑制miR155HG表达对肺癌A549细胞增殖、迁移 侵袭相关蛋白表达的影响

2.5miR-409-3p过表达对肺癌A549细胞增殖、迁移侵袭的影响 相较于miR-NC组，miR-409-3p组CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白表达水平均显著降低，p21及miR155HG表达水平均显著升高(均P=0.000)；A549细胞抑制率显著升高(P=0.000)；细胞迁移和侵袭数量均显著减少(均P=0.000)。见图5、表5。

图5 miR-409-3p过表达对肺癌A549细胞增殖、迁移侵袭 相关蛋白表达的影响

表5 miR-409-3p过表达对肺癌A549细胞增殖、迁移侵袭的影响

2.6miR155HG过表达逆转了淡豆豉提取物(400 μg/ml)对肺癌A549细胞增殖、迁移侵袭的作用 相较于淡豆豉提取物+pcDNA组，淡豆豉提取物+pcDNA-miR155HG组CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白表达水平均显著升高，p21蛋白表达水平显著降低(均P<0.05)；A549细胞抑制率显著降低(P<0.05)；细胞迁移和侵袭数量均显著增加(均P<0.05)。见表6、图6。

表6 miR155HG过表达逆转了淡豆豉提取物对肺癌A549细胞增殖、迁移侵袭的作用

1～4:对照组、淡豆豉提取物组、淡豆豉提取物+pcDNA组、淡豆豉提取物+pcDNA-miR155HG组图6 miR155HG过表达逆转淡豆豉提取物对肺癌A549 细胞增殖、迁移侵袭相关蛋白表达的影响

3 讨 论

肺癌的发病率和死亡率不断升高，严重影响着人类的生命健康，中医药是肺癌的主要治疗手段之一，其联合靶向药物和化疗具有增效减毒和逆转耐药的作用〔12〕。淡豆豉醇提物有体外抗肝癌、乳腺癌细胞生长的作用，并具有一定的时间、剂量依赖性〔13，14〕。淡豆豉还可提高2型糖尿病模型大鼠抗氧化能力，减少炎性因子肿瘤坏死因子(TNF)-α的释放，缓解其氧化应激损伤和炎性损伤〔15〕。本研究说明淡豆豉提取物能抑制肺癌细胞A549增殖，迁移和侵袭，且具有浓度依赖性。

LncRNA miR155HG在肿瘤发生中起重要作用，miR155HG在胰腺癌组织和细胞中显著上调表达，干扰其表达可抑制胰腺癌细胞的生长，促进细胞凋亡〔16〕。miR155HG在喉鳞癌组织中也高表达，敲除miR155HG抑制喉鳞癌细胞的增殖、迁移和侵袭〔17〕。miR155HG在胶质母细胞瘤中表达上调，下调其表达可抑制癌细胞的增殖，促进细胞凋亡〔18〕。本研究结果说明抑制miR155HG表达能抑制肺癌细胞A549增殖，迁移和侵袭。且本研究发现miR155HG可靶向调控miR-409-3p的表达。

研究报道miR-409-3p在肺腺癌组织中下调表达，上调miR-409-3p可抑制肺腺癌细胞的生长、迁移和侵袭，促进细胞凋亡〔19〕。过表达miR-409-3p还可抑制乳腺癌、舌鳞状细胞癌细胞的增殖、迁移和侵袭〔20，21〕。本研究结果说明过表达miR-409-3p能抑制肺癌细胞A549增殖，迁移和侵袭；miR155HG过表达逆转了淡豆豉提取物对肺癌A549细胞增殖、迁移侵袭的抑制作用。以上结果表明，淡豆豉提取物可能通过调控miR155HG进而靶向调控miR-409-3p影响肺癌细胞A549的增殖、迁移和侵袭。