血清miR-211对糖尿病视网膜病变的诊断价值及其影响因素分析

刘琪，王绍飞，丁琳，秦艳莉，麦迪娜·那毕江

(新疆维吾尔自治区人民医院眼科,乌鲁木齐 830001)

2型糖尿病是一种内分泌代谢性疾病，糖尿病视网膜病变(DR)是其常见的并发症之一，属于严重的全身微血管并发症[1]。早期研究多认为，DR的发病机制与血管内皮功能损伤、糖基化末端产物及高糖应激损伤等机制有一定的关系[2]。近年来研究显示，微小RNA(miRNA)参与了细胞的增殖、分化和凋亡等生理过程，且在血管病变中起到关键性作用，并进一步证实其对血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)信号通路的传导过程产生影响[3]。有学者证实，miR-211在糖尿病及眼部并发症进展过程中具有重要作用，高糖环境下其表达水平会显著增加[4]，但是其表达水平对DR影响的机制尚不明确。因此，本研究旨在检测并评估血清miR-211对DR的诊断价值，并对其影响因素进行分析。

1 对象与方法

1.1研究对象 收集2018年12月至2020年10月新疆维吾尔自治区人民医院眼科收治的DR患者90例作为DR组，男46例，女44例，年龄(65.93±9.92)岁，并进一步分为增生型糖尿病视网膜病变(PDR，n=31)和非增生型糖尿病视网膜病变(NPDR，n=59)。纳入标准：原发性2型糖尿病且病程不低于2年；所有患者均符合2014版DR临床诊疗指南标准中关于DR的诊断标准[5]，未接受抗DR的相关治疗；屈光介质及眼压正常；临床资料完整。排除标准：近期有创伤史及手术史；伴有全身恶性肿瘤、肝肾功能障碍及心脑血管严重病变患者；伴有青光眼、白内障、视神经疾病及视网膜静脉阻塞等其他眼部疾病患者；患有糖尿病的其他并发症患者；伴有急性或慢性感染患者；伴有甲状腺功能亢进及库欣综合征等对糖代谢造成影响的疾病患者；伴有自身免疫系统疾病患者；长期使用抗精神疾病类药物或糖皮质激素类药物患者；哺乳期或妊娠期妇女；无法配合眼科检查患者；临床资料不完善患者。选择本院同期收治的单纯2型糖尿病患者(未合并DR)45例作为NDR组，均符合中国2型糖尿病防治指南中2型糖尿病诊断标准[6]，男21例，女25例，年龄(65.89±9.87)岁。另选同期在本院进行体检的健康受试者45例作为健康人对照组，男23例，女23例，年龄(66.01±10.22)岁。各组受试者的基本资料见表1。本研究经新疆维吾尔自治区人民医院医学伦理学委员会审核批准(批准文号：LY-2018-03)，受试者均知情同意。

1.2主要试剂及仪器 VEGF双抗体夹心酶联免疫吸附试剂盒(美国R&D公司)，DEPC水(天根生化科技公司)，Trizol LS试剂(美国Thermo Fisher Scientific公司)，氯仿、乙酸、乙醇(中国国药集团化学试剂公司)，RNA纯化试剂盒(德国Qiagen公司)，二甲亚砜(DMSO，美国Sigma-Aldrich公司)，逆转录试剂盒(日本TaKaRa公司)。低温、低速离心机(德国Heracus公司)，超低温冰箱(日本Sanyo公司)，紫外分光光度计(美国Thermo Fisher Scientific公司)，CFX96型荧光量PCR仪(美国Bio-Rad公司)。

1.3方法

1.3.1标本采集 采集所有受试者入组时(体检健康者于体检时采集)及餐后2 h空腹肘静脉血4 mL于非抗凝采血管中，室温静置30 min，4 ℃、1 200 r/min离心10 min，取上清液500 μL分装于1.5 mL无菌Eppendorf管中，置于-80 ℃保存。另采集各组空腹外周静脉血3 mL于非抗凝采血管中，5 000 r/min离心5 min后取上清备用。

1.3.2RNA提取及逆转录实时荧光定量PCR(RT-qPCR) 取上述各组的血清标本500 μL，按照Trizol LS试剂说明书提取总RNA，并根据RNA纯化试剂盒说明书对RNA进行纯化，采用紫外分光光度计检测其吸光度(A260/280 nm)，取比值为1.8～2.0的样本用于后续试验，并置于-80 ℃保存。按照逆转录试剂盒说明书将RNA逆转录为cDNA。miR-211及U6引物设计与合成均由上海生工公司完成。 miR-211上游引物序列：5′-TCGGCAGGTCCCTTTGTCATCC-3′，下游引物序列：5′-TGCAGGTCAACTGGTGTCGT-3′；U6上游引物序列：5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′，下游引物序列：5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′。 PCR总反应体系为25.0 μL，包括：10×PCR buffer 2.5 μL，dNTP Mixture 1.0 μL，10 μmol/L上、下游引物各0.5 μL，cDNA 0.5 μL，ExTaq酶0.25 μL，ddH2O补足体积至25 μL。循环参数：94 ℃预变性5 min ；94 ℃ 45 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，72 ℃延伸10 min， 28～36个循环；4 ℃保存。采用CFX96型荧光定量PCR仪配套软件于61 ℃时采集荧光信号，以U6为内参照，采用=2-△△Ct法计算miR-211的相对表达量。每个样本设3个复孔，取均值。

1.3.3VEGF水平测定 取上述各组上清标本50 μL，采用双抗体夹心酶联免疫吸附法(ELISA)测定血清中VEGF的表达水平，所有操作均严格按照试剂盒说明书操作及结果判读。

2 结果

2.13组受试者临床资料比较 3组受试者的年龄和性别等基本资料比较差异均无统计学意义(P>0.05)，但空腹血糖、糖化血红蛋白比较差异有统计学意义(P<0.05)。组间两两比较结果表明，DR组和NDR组患者空腹血糖、糖化血红蛋白的表达水平均显著高于健康人对照组(P<0.05)，且DR组亦高于NDR组(P<0.05)。结果见表1。

表1 3组受试者临床资料比较结果

2.23组受试者血清VEGF水平及血浆中miR-211表达量的比较 3组受试者血清VEGF水平及miR-211相对表达量比较差异具有统计学意义(P<0.05)；组间两两比较结果表明，NDR组和DR组患者血清VEGF水平和miR-211的相对表达量均显著高于健康人对照组，且DR组高于NDR组(P<0.05)。见表2。

表2 3组受试者血清VEGF水平及miR-211相对表达量的比较

2.3不同分期DR患者血糖指标、血清VEGF水平及miR-211相对表达量比较 PDR组患者血清VEGF水平、miR-211相对表达量、糖化血红蛋白和空腹血糖水平均显著高于NPDR组(P<0.05)。见表3。

表3 不同分期DR患者血糖指标、血清VEGF水平及miR-211相对表达量比较

2.4DR患者血浆miR-211相对表达量的影响因素分析 多因素Logistic回归分析结果显示，性别和年龄不是DR患者血浆miR-211相对表达量的影响因素；但DR分期、空腹血糖、糖化血红蛋白、血清VEGF及病程均是DR患者血浆中miR-211相对表达量的影响因素。见表4。

表4 DR患者血浆中miR-211相对表达量的影响因素分析

2.5DR患者血浆miR-211相对表达量与糖化血红蛋白、空腹血糖及血清VEGF水平的相关性分析 相关性分析结果显示，DR患者糖化血红蛋白、空腹血糖及血清VEGF水平与miR-211的相对表达量均呈正相关(r值分别为0.879、0.763、0.775，P均<0.001)。

2.6ROC曲线评估miR-211诊断DR的效能 采用ROC曲线评估miR-211对DR的诊断效能，将DR组赋值1，NDR组和健康人对照组赋值0，结果显示， miR-211诊断DR的ROC曲线下面积(AUCROC)及95%CI分别为0.839(95%CI:0.785～0.894，P<0.001)，当cut-off值为2.23时，其敏感性和特异性分别为72.4%和75.0%。

3 讨论

DR作为糖尿病微血管并发症之一，是损害视功能甚至造成失明的重要原因，DR的发生、发展过程与miRNA及VEGF基因的调控关系密切[7]。miRNA可以特异性作用于靶基因序列，在转录水平后对基因的表达进行调节，进而在多种生物学过程中发挥作用[8]。血液循环中的miRNA是理想的生物学标志物之一，具有稳定性高、灵敏度高、易获取及非入侵性等特点，其表达水平的异常改变较其所调控的蛋白质表达改变时间上更早，在糖尿病患者尚未出现视网膜病变时其表达水平已出现异常[9]。研究证实，miRNA在心脏病及糖尿病肾病等糖尿病血管并发症中可反映病变组织的病理变化，是有效的生物学标志物[9]。DR进展过程中造成的视网膜血管内皮损伤可使细胞中miRNA大量渗漏进入循环系统，从而引起血清中miRNA水平升高[10]。

有学者证实，miR-211表达于人类各种眼组织中，与糖尿病及眼部并发症密切相关，高糖环境中miR-211表达显著增加，对细胞的凋亡具有促进作用，且可对细胞增殖造成抑制，引起组织缺氧、缺血及细胞功能受损，致使组织失去活性[11]。本研究结果显示，DR患者血浆miR-211的表达水平及血清VEGF水平均显著高于单纯2型糖尿病患者及健康受试者，且PDR患者血浆miR-211的表达水平及血清VEGF水平亦显著高于NPDR患者，分析原因可能为高表达的miR-211对视网膜血管微环境中的视网膜内皮细胞的凋亡具有促进作用，破坏视网膜血管的结构，增加通透性，进而使miR-211表达水平增加[12]。

本研究结果还显示，DR分期、空腹血糖、糖化血红蛋白、血清VEGF及病程对DR患者血浆miR-211的相对表达量均有一定的影响作用，且DR患者糖化血红蛋白、空腹血糖及血清VEGF水平与miR-211的相对表达量均呈正相关。由于血糖控制不佳会造成DR病情加重，糖化血红蛋白可有效反馈血糖的控制水平，作为晚期糖基化的一种产物，其浓度的增加及大量的沉积会使糖基化中的膜产物受体表达被激活，促进氧自由基的释放，引起组织缺氧，增加血管的通透性，诱发形成新生血管，使DR病情加重[13]。VEGF在促进血管生成中具有关键性作用，可直接影响新血管生成及血管通透性，与DR疾病进展关系密切。血糖控制不佳会引起miR-211表达水平增加，损害血管内皮，影响血管内皮功能，从而加重DR病情[14]。此外，本研究还通过ROC曲线分析证实，血浆miR-211的表达水平对DR具有较高的临床诊断效能。

综上所述，DR患者miR-211表达水平显著高于单纯2型糖尿病患者及健康受试者，且受DR分期、空腹血糖、糖化血红蛋白、血清VEGF及病程影响，并与糖化血红蛋白、空腹血糖及血清VEGF水平呈正相关，对DR具有较高的诊断效能，后续研究中我们将会扩大样本量，并纳入民族、地域等因素，进一步对miR-211在视网膜病变中的作用机制进行研究。