分析前因素对血液乙肝表面抗原检测的影响*

孙俊艳，何成涛，刘海波，陈跃

(1.淮安市中心血站检验科，江苏淮安 223001；2.南京红十字血液中心研究室，南京 210003)

乙肝表面抗原(HBsAg)是筛查乙型肝炎最重要的血清学指标，标本质量保证是检测结果准确性的重要分析前因素[1]，国内有学者对实验室分析中仪器产生影响因素、明显溶血标本或送检时间进行研究，指出标本溶血和室温保存4 h以上可影响检测结果准确性[2-3]。但往往标本被非规范处理后，标本溶血、抗凝不充分等现象表现不明显，使工作人员无法直观判断出标本是否合格，且无法对检测结果正确赋值。本研究拟通过设计5种模式，验证从标本采集到检测前各种因素对检测结果的影响情况，旨在指导标本的处理流程，最大限度的保证标本质量，消除标本对检测结果的影响。

1 材料与方法

1.1仪器与试剂 STAR 8CH全自动酶免前处理系统、FAME24/20全自动酶免后处理系统(烟台奥斯邦生物研发公司)，DL-5M低速冷冻离心机、KH20自动开盖离心机(湖南湘仪实验室仪器公司)，EDTA-K2抗凝管(江苏康健医疗用品公司)，分离胶促凝管(江苏康健医疗用品公司)。HBV酶联免疫检测试剂盒(北京万泰股份公司)，酶联四项质控标准血清(北京康彻思坦生物技术公司)。

1.2方法

1.2.1研究对象 收集2019年4月至11月于淮安市中心血站自愿无偿献血的300例献血者的血液标本。女性78例，男性222例，年龄(40±2)岁。纳入标准：献血前征询、初筛、体检均符合《献血者健康检查要求》2011版要求，均由熟练工作人员进行采集，献血者知晓本研究，自愿参与。排除标准：献血前征询、初筛、体检不符合《献血者健康检查要求》2011版要求，不能参加献血者；标本采集量不足或标本遭到污染时；标本不能按计划时间进行检测的；献血者依从性差，无法完成本研究者。

1.2.2常规标本处理步骤 要求同一工作人员采用EDTA-K2抗凝管采集每位献血者2管血液，每管样本量为4～5 mL，标本无脂肪、无溶血现象，采集后临时储存环境为2～8 ℃。离心温度为室温(18～27 ℃)条件下进行分离，离心半径21 cm，3 000 r/min离心10 min，2管同时分别进行20次检测。

1.2.3分组模式 分别采取不同离心温度、采集到离心不同时间间隔、不同离心和储存顺序、不同标本管类型、不同储存温度5种不同模式进行处理，每种方法采样60人。5种模式中保证标本只有设计的影响因素不同，其他操作处理方法与常规操作步骤完全相同。

1.2.3.1不同离心温度(以CT表示) 2支标本离心时分别采取室温(18～27 ℃)和4 ℃离心，4 ℃离心使用低速冷冻离心机，离心半径21.5 cm，3 000 r/min离心10 min，分别编为A、B组。

1.2.3.2采集到离心不同时间间隔 (以Ct表示) 从采集到标本进行离心处理的时间间隔为0 h和8 h的2支标本管分别编为C、D组。

1.2.3.3不同离心和储存顺序 (以Tm表示) 将标本管标本离心后储存和储存后离心2种情况的2支标本管分别编为E、F组，E组标本采集后立即离心后储存于2～8 ℃ 4 h，F组标本采集后立即储存于2～8 ℃，4 h后进行离心。

1.2.3.4不同标本管类型 (以At表示) 分别采用抗凝和促凝管采集的2支标本管分别编为G、H组。

1.2.3.5不同储存温度 (以ST表示) 标本采集后分别进行室温(18～27 ℃)和立即置于2～8 ℃储存的2支标本管分别编为I、J组，2种均在对应温度下储存2 h以上，再进行离心处理。

1.2.4计算公式 配对设计的标准偏差计算公式为：

注：n为样本例数,d为同一样本两组测量结果之差，dm为同一样本两组数据差值平均值。

1.3统计学分析 采用SPSS 25.0统计软件进行配对t检验，以P<0.05为差异有统计学意义，利用EXCEL 2007电子表格进行数据处理及复合标准差的计算。

2 结果

2.15种不同的因素对结果的影响 由表1可见，标本采集后处理时离心温度、标本采集到离心时间间隔、储存温度3种模式中两组处理方式之间的平均值之差分别为0.004 0、0.003 1、0.002 2，经统计，对HBsAg检测结果的影响差异均有统计学意义(P<0.05)。离心与储存顺序、标本管类型2种模式中两组处理方式之间的平均值之差分别为0.000 3、0.000 2、经统计，对HBsAg检测结果影响差异无统计学意义(P>0.05)。

表1 5种因素对HBsAg检测结果影响

2.25种不同的因素的影响程度 据1.2.4中公式计算离心温度、标本采集到离心间隔、离心和储存顺序、标本管类型、储存温度5种因素复合标准差，结果分别为0.005 5、0.004 5、0.002 6、0.002 0、0.004 9。影响程度由大到小依次为离心温度、储存温度、标本采集到离心间隔、离心和储存顺序、标本管类型。

3 讨论

影响实验室检测结果准确性因素主要有人员、仪器、试剂、实验方法、标本质量等方面。自动化测量仪器的推广和性能方面的持续改进、仪器的定期校验及对室内质控的重视度增强均可有效控制分析中的各种影响因素。由于分析前的环节涉及较多，很多学者[4-5]认为可以通过强化分析前的规范化加以控制，但工作人员责任心及操作的熟练度差异，使标本的处理流程难以达到预期要求，这给分析前标本质量控制带来很大难度，而实验室标本接收普遍通过肉眼观察判断标本合格性，这为检测结果准确性带来一定的负面影响。

本研究显示，标本采集后处理时离心温度、标本采集到离心时间间隔、储存温度3种模式对HBsAg检测结果具有很大影响。笔者分析原因认为，常温离心时随着离心时间加长，转速增高，在离心机没有温度控制功能时，离心温度会逐渐增高，细胞会发生破坏。如果全血标本常温储存较长时间，特别是环境温度较高时，细胞同样发生破坏，产生肉眼不可见的隐形溶血，释放多种内源性干扰物质，干扰检测结果。这与杨瑞锋等[6]研究观点相一致。另一方面全血标本在不分离状态下储存8 h时，随着细胞的死亡，释放一些生物活性物质或残留细胞成分的干扰，均导致检测结果假阳性产生，这与赵鸿翔等[7]和谯兴强等[8]的观点相一致。

离心与储存顺序和标本管类型模式对HBsAg检测结果的影响无统计学意义，考虑到血浆与血清的主要区别是血清不含纤维蛋白原，血浆标本留取时抗凝充分，纤维蛋白原没有析出，未对检测结果造成明显影响。因此，在日常工作中可以替代使用。而离心与储存顺序设计时储存温度在2～8 ℃环境中4 h，低温环境中标本比较稳定，在小于4 h的情况下溶血现象不明显，未对检测结果造成明显影响。

综上所述，确保HBsAg检测结果的准确性，不仅实验室需要对分析中的各种因素加以控制，还要规范分析前全血标本的处理流程。虽然一些规范对标本采集后处理有一定要求，但由于环节较多、经手人员复杂等原因，对于规范的执行落实情况不到位，从而对标本质量产生不可预估的影响。本研究用数据验证了标本处理环节中关键控制点，结果提示：为保证检测结果准确性，全血标本采集后应立即使用低温离心机进行分离，否则应立即放入2～8 ℃环境中保存，4 h内持续保持该温度并使用低温离心机分离，如果标本发生明显溶血，应重新留取标本。