microRNA在复发性流产中的研究进展*

王志琴，谢开鹏，钟天鹰

(南京医科大学附属妇产医院，南京市妇幼保健院a.医学检验科，b.医学研究中心，南京 210000)

复发性流产(recurrent spontaneous abortion, RSA)一般指与同一性伴侣连续发生3次及3次以上的自然流产[1]。不同国家或地区对RSA定义存在争议，争议点主要是流产发生的孕周、次数、是否连续发生、以及是否为同一性伴侣[1-2]。RSA的发病原因复杂，早期RSA的最常见原因是胚胎染色体异常，晚期RSA最常见原因为子宫解剖异常[1]。目前，临床上诊断或预测RSA的检测指标效能不佳，部分原因明确的RSA和不明原因的复发性流产(unexplained recurrent spontaneous abortion, URSA)的治疗仍然是妇产科领域的难点和挑战。

微RNA(microRNA, miRNA)是一种短小分子的非编码单链RNA，其长度约为22个碱基，广泛参与机体的病理、生理过程[3]。人类许多疾病都与miRNA的异常表达有关，包括癌症、心血管疾病、子痫前期等[4-5]。研究发现，与健康孕妇相比，RSA患者血液、绒毛和蜕膜组织中的miRNA表达存在显著差异性[6-8]，这为探索RSA的发生机制提供了新的思路。由于miRNA本身具有较好的稳定性和组织特异性，因此，miRNA有可能成为RSA的诊断标志物[3,9-10]。本文通过综述RSA相关miRNA的研究进展，以期为RSA的诊疗提供新思路。

1 人群关联研究

RSA的人群关联研究通常所用的样本为蜕膜组织[6]、绒毛组织[8]、血浆[8]、血清[8]，所用的对照组多为人工流产的正常孕妇(normal pregnancy, NP)手术前采集血样或手术时采集蜕膜或绒毛组织。研究设计上一般首先采用miRNA芯片[11-12]或深度测序技术[13-14]获得差异miRNA表达谱，常见的选择标准有差异倍数(Fold-change, FC)≥2(或≤0.5)且P<0.05[11,15-17]；然后再从表达谱中选择几个miRNA通过实时定量PCR(quantitative real-time PCR, qRT-PCR)进行验证。以下根据研究所用的样本类型分类进行叙述。

1.1蜕膜组织 蜕膜在妊娠前3个月侵入子宫黏膜，是控制滋养层入侵深度的关键，蜕膜含有较多的自然杀伤细胞(natural killer cells, NKCs)，且与血液中NKCs的表型和功能显著不同[6]。有学者发现，蜕膜组织自然杀伤细胞(decidual natural killer cells,DNKCs)可分泌血管内皮生长因子C，介导滋养细胞的侵袭和血管重构[18]，故而蜕膜及其免疫细胞对维持妊娠起重要作用。Li等[6]通过文献复习选出了6个可能与URSA发生、发展有关的miRNA(miR-34a、miR-155、miR-141、miR-125a、miR-125b、miR-24)；随后收集了20对URSA患者和NP妇女的蜕膜组织，用qRT-PCR检测DNKCs中该6个miRNA的表达水平，结果显示miR-34a、miR-155、miR-141、miR-125a、miR-125b表达上调，miRNA-24表达下调；该课题组进一步采用miRNA芯片检测了5对URSA患者和NP妇女蜕膜组织中DNKCs的miRNA表达谱，结果发现50个差异表达的miRNA(49个上调，1个下调)[15](FDR<0.05，P<0.005)；然而，该50个表达差异的miRNA并不包括前一项研究中的6个差异表达的miRNA，分析原因可能是二者所用的样本量和检测技术的不同造成的。Zhao等[12]收集14例RSA 患者和13例NP妇女的蜕膜组织进行了病例-对照研究，采用基因芯片和层次聚类方法筛选出了17个差异表达的miRNA；进一步通过定量PCR(quantitative polymerase chain reaction, qPCR)证实了其中4种表达上调(miR-150、miR-365、miR-10a、miR-27c)，4种表达下调(miR-24、miR-30c、miR-181、miR-20)。另有学者发现，miR-24在RSA蜕膜组织[12]和URSA蜕膜组织[6]DNKCs中均表达下调。然而，目前研究中，不同学者研究所得的RSA蜕膜组织miRNA谱中没有表达趋势一致的miRNA。

1.2绒毛组织 胎盘绒毛组织对建立胎盘循环和胎儿的物质交换至关重要，同样，用绒毛组织作为样品筛选差异性表达miRNA的研究中，不同研究所得的miRNA表达谱中也很少有相同的miRNA[8,11,13]。Gu等[14]通过深度测序筛选了3对RSA和NP患者绒毛组织中差异表达的69个miRNA，其筛选标准为FC>1.5且P<0.05；随后该研究者收集12例RSA和10例NP妇女的绒毛组织，进一步使用qRT-PCR及动物实验证实了RSA绒毛组织中miR-486-3p表达下调，miR-3074-5p表达上调。但其他学者[8,11,13,16]用绒毛组织筛选所得的差异性miRNAs中并不包括这2个miRNA，存在差异的原因可能是不同研究者选择不同的筛选技术和检测平台(不同实验室)所致，有的选择miRNA芯片[11,16]，有的选择深度测序技术[8,13]，即便选择同一种技术，不同实验室检测平台的检测效能可能差异较大。

1.3血液 血液循环miRNA的研究对RSA诊断标志物和无创检测技术的探索有重要的意义。Karami等[7]在一项病例-对照研究中比较了25对URSA患者和NP妇女血浆miR-21的表达水平，发现URSA患者血浆miR-21的表达水平显著降低，同时该研究也比较了25对URSA患者和NP妇女外周血单核细胞中miR-21的表达水平，结果显示URSA患者外周血单核细胞中miR-21的表达水平也显著降低；但Yang等[8]和Qin等[17]所筛选的差异性循环miRNA和候选miRNA标志物中均不包括miR-21。Yang等[8]收集了16例RSA患者和29例NP妇女的外周血样本进行病例-对照研究，并通过Logistic回归分析分别评估血浆和血清中2个组合模型(组合模型一：6个miRNA：miRNmiR-23a-3p，miR-27a-3p，miR-29a-3p，miR-100-5p，miR-127-3p，miR-486-5p；组合模型二：2个miRNA：miR-127a-3p，miR-486-5p)预测复发性流产的预测性能、敏感性、特异性、分类正确率，结果发现血浆组合模型一诊断RSA的敏感性和特异性分别为100%和83.3%，其评估后认为循环miR-23a-3p，miR-27a-3p，miR-29a-3p，miR-100-5p，miR-127-3p，miR-486-5p是非常有潜力的RSA预测因子。Qin等[17]通过基因芯片和qRT-PCR在血浆中筛选出了5个miRNA(miR-320b、miR-146b-5p、miR-221-3p、miR-559，miR-101-3p)，其认为这5个miRNA具有作为URSA生物学标志物的潜力。

关于RSA的人群研究情况见于表1(部分未在文中描述)。通过病例-对照研究可筛选差异性表达的miRNA，这为RSA的生物标志物筛选和进一步机制探索提供了研究方向，但是已有的研究的最大问题是不同研究者筛选所得的差异性表达miRNA不一致，人群的种族来源、样本量大小、样本收集的排除及纳入标准，以及提取miRNA的技术、差异性miRNA筛选技术、不同实验室技术平台敏感性和特异性、统计学指标的选择等均有所不同，这些可能是导致不同研究筛选结果差异较大的原因，故需扩大样本量、规范样本的排除及纳入标准、应用更精确的筛选和验证检测技术以提高研究结果的可靠性。

表1 RSA人群研究中miRNA的研究情况

2 分子机制研究

目前多数关于miRNA在RSA方面机制功能研究首先通过生物信息学数据库进行靶基因预测、通路分析、基因本体论分析、相关转录因子预测等，然后进行体外实验或体内实验验证[19]。靶基因预测常用的数据库是TargetScan Release、miRanda[6,15]；基因本体论分析(Gene ontology analysis)包括细胞组分、分子功能、生物过程3个方面；通路分析(Pathway analysis)常用数据库为《京都基因与基因组百科全书》(KEGG：Kyoto encyclopedia of genes and genomes)、Biocarta数据库、Reatome数据库[6,15]。

2.1miRNA与细胞的增殖、凋亡 Zhang等[21]认为miR-184以野生型p53诱导基因1(wild-typep53-induced gene1,WIG-1)作为靶基因上调Fas的表达，进而促进HTR-8人绒毛膜滋养层细胞的凋亡；Zhao[12]等通过基因芯片、层次聚类法、qPCR法筛选出在蜕膜中差异性较大的miR-365，再经过靶基因预测和HTR-8/SVneo及HPT-8人绒毛膜滋养层细胞实验，验证了上调的miR-365以血清/糖皮质激素调节激酶1(serum glucocorticoid-regulated kinase 1,SGK1)基因为靶基因，降低SGK1的表达，促进滋养细胞凋亡，参与RSA的发生。另有学者通过蜕膜细胞转染实验显示，miR-378a-3p模拟物可促进细胞增殖、抑制细胞凋亡，而黄体酮可以诱导蜕膜细胞中miR-378a-3p的表达，而miR-378a-3p下调可诱导蜕膜细胞凋亡[22]。由上述研究可推测一种妊娠重要细胞(比如蜕膜细胞等)的增殖、凋亡同时受多个miRNA调控，关于妊娠重要细胞增殖、凋亡的miRNA调控网络和机制有待更多研究者的探索和揭晓。

2.2miRNA与妊娠免疫耐受 胎儿是同种半异体移植物，正常母体不排斥胎儿的具体机制尚不清楚。HLA-G被认为赋予胎儿-母亲免疫耐受功能，以确保妊娠成功，且在整个孕期表达于胎盘组织，Wang等[11]研究发现，RSA患者绒毛组织中miR-133a的表达上调，可通过靶向抑制HLA-GmRNA的翻译而显著降低HLA-G蛋白的表达水平，该结果虽然提示miRNA可能调控妊娠免疫耐受，但是还需要更深入的体外实验和体内实验验证。

2.3miRNA与胎盘血管生成 胎盘血管的物质交换功能是保证胎儿健康生长发育的关键，Zhu等[19]发现，RSA患者绒毛和蜕膜中显著上调的miR-16能抑制人脐静脉内皮细胞的增殖、迁移和成管，而miR-16的下调会逆转这些效应，虽然此项研究结果提示miR-16对胎盘血管生成可能有重要作用，但是miR-16对人类胎盘血管生成的具体机制尚无更详细的研究。 miRNA可能通过影响胎盘组织的细胞增殖、凋亡、血管生成、免疫耐受参与复发性流产的发生。miRNA调节机制非常复杂[9,17]，1条miRNA可以有多个靶基因，多个miRNA也可以有相同的靶基因或效应，miRNA如何参与复发性流产机制的研究目前还没有突破性的研究。

3 目前研究需改善方面

3.1人群研究对照的选择 目前的人群研究皆以人工流产的健康孕妇为对照筛选RSA的差异性miRNA表达谱，但怀孕是一个动态变化的过程，孕妇的怀孕过程是否顺利，胚胎是否发育健全，胎儿是否健康，这些都应该是健康孕妇作为对照的关键，而流产的健康孕妇的胚胎是否能够发育健全，胎儿发育是否健康，整个孕期是否顺利，都是无法保证的，故而用孕期顺利并且能够最终分娩健康胎儿的正常孕妇作为对照可能会获得质量更高的差异性miRNA表达谱。

3.2循环miRNA的来源 尽管RSA miRNA的相关研究未提出miRNA的来源问题，但已有研究表明胎盘来源的核酸会释放到母体血浆中[23]。有些研究发现同一miRNA在不同标本中的表达趋势是相反的，例如Yang等[8]研究发现，血浆和血清中miR-23a-3p、miR-127-3p和miR-486-5p的表达水平是相反的，其认为出现这种现象的原因可能是miRNA的来源不同，所以探索RSA循环miRNA的来源可能会成为这个领域的研究方向。

一项关于产前诊断的研究通过比较miRNA在胎盘与外周血细胞表达的倍数，筛选出了4种胎盘表达丰富的miRNA(miR-141、miR-149、miR-299-5p和miR-135b)，并研究了10对分娩前后母体血浆中这4种miRNA的血浆检出率，结果表明，其检出率分别为：miR-141[100% (分娩前检出率)，50% (分娩后检出率)]，miR-149(80%，0%)，miR-299-5p(50%，20%)，miR-135b(20%，0%)，其中血浆miR-141随着妊娠进展浓度升高，该研究还探索了miRNA-141在母体血浆中的物理性质，因为绒毛膜生长催乳素1(chorionic somatomammotropin 1, CSH1)转录本在分娩前母体血浆中较容易被检测到，所以通过比较miRNA-141与CSH1编码的mRNA的稳定性，评估miR-141的稳定性，将血浆通过不同孔径过滤器过滤和纯化后检测miR-141的表达量变化，结果显示miR-141在母体血浆中的表达水平更加稳定[24]，这种妊娠相关miRNA动态变化和稳定性研究对RSA miRNA研究有启发意义。众多研究筛选出的差异miRNA表达谱差异较大也可能是因为不同孕周的RSA患者的miRNA表达有差异性，所以，研究健康孕妇的差异性表达miRNA，并确定其在整个怀孕过程中的动态变化，进一步确定不同孕周发生流产的差异表达miRNA，这对探索miRNA在RSA中的功能机制具有重要的意义。

3.3miRNA检测技术 miRNA检测是miRNA临床研究的重要部分，近年有关miRNA表达的临床研究大多使用深度测序技术[13-14]、miRNA芯片[11-12]、PCR[11-14]这3种技术。深度测序技术是第二代测序技术，又称高通量测序技术，具有较高的准确性和灵敏度，其主要的优点是能够发现新的miRNA和区别miRNA的变异，但是该技术价格昂贵，数据分析需要大量的计算支持[25-26]。相比深度测序技术，基因芯片是检测miRNA表达的传统技术，成本低，但该技术的检测灵敏度和特异性低，获取结果时间长[26]。PCR检测技术的原理简单，设备自动化程度很高，使用方便，一般实验室都可实施，不仅有较高的灵敏度、特异性，还可用于绝对定量，与深度测序和miRNA芯片相比，有较好的重复性[26]。miRNA的PCR反应有其特殊之处，由于miRNA短小，在逆转录时，通常会使用miRNA通用的加尾法逆转录引物或特异性的茎环法逆转录引物，延长miRNA的长度，然后进行qPCR[26-27]。其余高灵敏度的miRNA检测方式，如电化学检测技术[25]、表面等离子体共振(surface plasmon resonance,SPR)[25]，还不属于临床研究使用的常见技术。

随着基因扩增技术、分子标记技术、生物发光技术的进步，miRNA检测技术的灵敏度和重复性会得到极大提高，及时引入更先进的技术，对于分子量很小的miRNA有非常重要的意义。测序技术向着高通量、高准确度、低成本、长读取长度的方向发展，最新的第三代测序技术还不成熟，错误率高，可靠性差。目前，数字PCR逐渐成为较为流行的miRNA检测方法，在肿瘤或心血管病miRNA研究中已经得到广泛使用，数字PCR可以绝对定量检测miRNA，比qRT-PCR的灵敏度更高[28-29]。临床研究检测少量miRNA时，也许可以考虑使用电化学检测技术等灵敏度很高的miRNA检测方法。以往研究存在的最大问题是同一检测方法的重复性差，比如，虽然不同研究者会选择同一种测序技术，但是因为选择不同的检测实验室测量平台，结果没有一致性，所以评估各检测平台的测量效能，制定技术平台指南或标准化方案，增强不同平台间实验重复性意义非凡。

4 小结及展望

目前用于RSA的标志物主要是血孕酮和hCG。动态测定血液hCG，其增长速度对妊娠预后有一定的预测作用；体内孕酮呈脉冲式分泌，血孕酮的测定值波动幅度大，对临床的指导意义不大[1]，所以临床上没有很好的检测指标能够诊断或预测RSA；在治疗方面，依据病因筛查，RSA的治疗方式有免疫治疗、手术治疗、抗凝治疗等[1]，但对于部分RSA，其治疗仍然是妇产科领域的难点和挑战。研究表明[22]，miR-378a-3p下调可诱导蜕膜细胞凋亡，而黄体酮可以诱导蜕膜细胞中miR-378a-3p的表达；所以miRNA可能成为RSA的诊断标志物和治疗工具。目前，流产相关miRNA的研究尚处于起步阶段，未来研究可以通过严谨的多阶段的人群研究以及队列研究设计等并辅以体内外分子生物学实验来剖析其具体的作用机制，这将有助于RSA的预防、诊断和治疗，推动该领域发展。