人补体因子H相关蛋白在膀胱癌的诊断、病理分级及临床分期中的应用价值

刘杨，张志平，彭道荣，邢瑞青，李静，赵媛，刘家云

(空军军医大学第一附属医院西京医院检验科，西安 710032)

人补体因子H相关蛋白(human complement factor H-related protein，hCFHrp)是由尿路上皮肿瘤细胞和巨噬细胞产生的，其可打断补体级联反应，使人体免疫系统不能很好地识别恶性肿瘤细胞，逃避宿主免疫系统，从而参与肿瘤细胞的发生、发展、侵袭和转移过程[1-2]。当膀胱发生肿瘤时，膀胱肿瘤细胞分泌的hCFHrp可与基底膜表面相关受体结合，释放蛋白水解酶水解基底膜，含hCFHrp的基底膜碎片释放至膀胱内聚合成相对分子质量Mr(×103)为16～165的高分子复合物,即膀胱肿瘤相关抗原(bladder tumor associated antigen，BTA)[3]。hCFHrp是BTA的具体成分，尿液BTA检测的抗原为补体因子H相关蛋白，故而传统将补体因子H相关蛋白简称为BTA。目前，尿液hCFHrp检测作为一种无创、便捷且经济的膀胱癌检测方法，越来越受到临床的重视。本文旨在研究尿液hCFHrp在诊断膀胱癌中的应用价值并分析其与患者临床病理参数的关系。

1 资料与方法

1.1一般资料 回顾性分析2020年4月至12月西京医院泌尿外科收治住院的膀胱癌患者的临床资料。纳入标准：(1)患者首次经膀胱镜电切除术或手术后送病理活检确诊为膀胱癌。(2)病理结果均由2名病理医师双盲阅片确诊。(3)患者在行膀胱镜电切除术或手术等泌尿系统有创检查前进行尿液hCFHrp检测，且未接受过任何泌尿系统疾病的治疗。(4)临床资料完整。排除标准：(1)合并有泌尿系统其他恶性肿瘤的患者。(2)合并有泌尿系统结石及肾功能下降的患者。(3)合并有其他部位肿瘤并接受过手术或放、化疗的患者。(4)血尿。依据以上标准，共纳入膀胱癌患者69例，其中男性45例，女性24例，年龄32～81岁，中位年龄62岁。TNM分期依据美国癌症联合委员会(American Joint Committee on Cancer，AJCC)标准：Ta～T1期35例，T2～T4期34例。病理组织学分级依据世界卫生组织(World Health Organization，WHO)标准：低分级34例和高分级35例。肿瘤大小依据病理报告，其中肿瘤直径<1 cm 23例，1～2 cm 26例，>2 cm 20例。回顾性分析同期本院收治的泌尿系统良性疾病患者的临床资料。纳入标准：(1)临床确诊为膀胱炎、膀胱结石、前列腺增生，前列腺炎及泌尿系感染。(2)尿液hCFHrp检测前未接受过泌尿系统有创检查。(3)临床资料完整。排除标准：(1)合并有泌尿系统及其他部位肿瘤患者。(2)肾功能下降患者。(3)血尿。共纳入泌尿系统良性疾病患者30例，其中男性19例，女性11例，年龄28～78岁，中位年龄58岁，其中膀胱结石7例，前列腺增生12例，泌尿系统炎症10例及腺性膀胱炎1例。另选取同期排除有泌尿系统疾病的体检健康者30例作为健康人对照组，其中男性20例，女性10例，年龄30～77岁，中位年龄59岁。

1.2主要仪器与试剂 Lumo化学发光分析仪(郑州安图生物公司)，hCFHrp定量测定试剂盒(微孔板化学发光法，北京普恩光德生物科技公司)。

1.3标本采集 所有研究对象用一次性尿杯留取晨起新鲜中段尿约10 mL，疾病组患者均在泌尿系统有创操作前及临床治疗前留取，尿液以3 000 r/min离心10 min，取上清至塑料试管中，置于-80 ℃冻存备检。

1.4hCFHrp检测

1.4.1实验前准备 将试剂盒从2 ℃～8 ℃冰箱取出，室温静置30 min以上平衡至室温(18 ℃～25 ℃)，20倍浓缩稀释液用纯化水或蒸馏水稀释20倍后使用。

1.4.2实验方法

1.4.2.1加样温育 取足够数量的包被板，固定于框架上，分别设置校准品孔、质控品孔、待测样本孔，记录各孔位置，按顺序在校准品孔中加入校准品50 μL，在质控品孔加入质控品50 μL，在待测样本孔中加入45 μL hCFHrp样品稀释液，按顺序在样本孔中分别加入5 μL的待测样品，等同于样本进行了10倍稀释，20 min内完成此步操作。每孔加入hCFHrp酶工作液50 μL，震荡混匀，加盖封板膜，37 ℃温育60 min。

1.4.2.2洗板 除去孔内液体，在干净的吸水纸上拍干，每孔加入35 μL洗液，静置5～10 s后弃尽，重复冲洗5次，最后在干净的吸水纸上拍干。

1.4.2.3测定 每孔加入50 μL化学发光液A和50 μL化学发光液B，充分混匀后置入Lumo化学发光分析仪检测并读数。

1.4.2.4计算 根据校准品的浓度及对应的光子数，均以校准品S0孔调零，使用双对数线拟合方式[log(X)-log(Y)]计算结果。将质控品对应的光子数带入标准曲线方程，计算出的结果即为质控品浓度；将样本对应的光子数带入标准曲线方程，计算出的结果按公式：C检测=C计算×10，转换成样本的检测浓度。

1.5统计学分析 采用IBM SPSS Statistics 23统计软件进行数据分析；计数资料用频数和率表示，组间比较用χ2检验；计量资料呈偏态分布，数据采用中位数(四分位数)[M(P25,P75)]表示，多组间比较采用Cruskal-WallisH检验，两组间比较采用Mann-WhitneyU检验；采用ROC曲线分析尿液hCFHrp对膀胱癌诊断的特异性、敏感性和cut-off值。

2 结果

2.1不同人群尿液hCFHrp浓度及阳性率的比较 膀胱癌组、良性疾病组及健康人对照组尿液hCFHrp浓度逐渐下降[182.37(90.14～584.22) U/mL，53.70(32.48～84.08) U/mL，20.7(9.10～34.30) U/mL]，差异有统计学意义(H=73.17，P<0.001)。进一步进行组间两两比较，结果发现膀胱癌组hCFHrp水平高于良性病变组(U=322.0，P<0.01)及健康人对照组(U=152.0，P<0.01)，而良性病变组hCFHrp水平高于健康人对照组(U=215.0，P<0.01)；此外，比较各组hCFHrp阳性率(取临界值89.03 U/mL)，3组间差异有统计学意义(χ2=60.14，P<0.001)，进一步进行组间两两比较，发现膀胱癌组阳性率为76.81%，显著高于良性病变组20.00%(χ2=28.06，P<0.001)及健康人对照组0.00%(χ2=49.59，P<0.001)，而良性病变组阳性率显著高于健康人对照组(χ2=6.67，P=0.024)，差异均有统计学意义。

2.2尿液hCFHrp与膀胱癌患者临床病理参数的关系 高级别组膀胱癌患者尿液hCFHrp水平及阳性率(取临界值89.03 U/mL)较低级别组显著升高，差异有统计学意义；T2～T4期的膀胱癌患者尿液hCFHrp水平及阳性率较T0～T1期患者显著升高，差异有统计学意义；膀胱癌患者尿液hCFHrp水平及阳性率随着肿瘤体积的增大呈上升趋势，差异亦有统计学意义。见表2。

表2 尿液hCFHrp与膀胱癌患者临床病理参数的关系

2.3尿液hCFHrp诊断膀胱癌的ROC曲线分析 以膀胱癌患者为疾病组，泌尿系良性疾病患者及健康人为对照组，绘制ROC曲线。结果显示，尿液hCFHrp诊断膀胱癌的ROC曲线下面积(AUCROC)为0.922，当cut-off值为89.03 U/mL时，其敏感性为76.80%，特异性为95.00%，约登指数为0.718。见图1。

图1 尿液hCFHrp诊断膀胱癌的ROC曲线

3 讨论

膀胱癌是我国泌尿系统最常见的恶性肿瘤，其具有恶性程度高，复发转移率高，预后差等特点[4]。传统的针对膀胱癌的诊断检查有腹部膀胱彩超、静脉尿路造影、 尿脱落细胞学检查及膀胱镜检查，但这些方法在灵敏度和可行性上均存在一定的弊端[5-6]。因此，近些年来针对膀胱癌的分子生物学诊断技术越来越受到关注。

目前，美国食品与药物委员会(FDA)己批准将hCFHrp等多项生物学标志物用于膀胱肿瘤的检查[7]，本研究通过微孔板化学发光法对不同人群的尿液hCFHrp含量进行检测，结果显示尿液hCFHrp含量在膀胱癌患者中显著升高，hCFHrp诊断膀胱癌的特异性较高，敏感性适中。朱有森等[8]和熊雄等[9]报道的尿液hCFHrp诊断膀胱癌的敏感性和特异性分别为72.3%和 89.6%以及85.96%和82.29%，与本研究结果比较存在较大差异，分析原因可能与本研究在选择膀胱癌患者入组时，严格排除了具有对尿液hCFHrp水平存在潜在影响因素的患者有关，如严重血尿，尿路感染，尿路结石等[10]，还可能与各项研究所收集的病例数量、肿瘤类型以及患者的尿液性状不同有关。hCFHrp是尿路上皮恶变时水解基底膜产生的基底膜碎片，但许多泌尿系统良性疾病也常会发生尿路移行上皮细胞破坏而致的基底膜破坏，从而导致尿液hCFHrp假阳性结果。因此，临床对hCFHrp检测结果的判定应综合hCFHrp潜在影响因素、患者的临床特征以及其他检测指标共同进行，尿液hCFHrp检测在膀胱癌的诊断上仍不能取代膀胱镜检及病理组织活检。本研究进一步分析了尿液hCFHrp与膀胱癌患者临床病理参数的关系，结果显示膀胱癌患者尿液hCFHrp浓度随着肿瘤向高级、高期进展而呈上升趋势，且与肿瘤大小有一定的相关性，这与文献报道一致[6，11-12]，表明尿液hCFHrp检测对临床判断肿瘤的恶性程度及疾病进程具有一定的价值，但本研究对缺少尿液hCFHrp对膀胱癌的预后评估。研究显示，不同尿液hCFHrp表达水平的膀胱癌患者，其 3年生存情况不同，hCFHrp 阳性患者3年生存率显著低于阴性患者，提示尿液hCFHrp 水平可作为膀胱尿路上皮癌患者预后评估的参考依据[8]。

本研究将血尿等因素作为患者纳入的排除标准，避免了因血尿等潜在干扰因素造成的假阳性结果，但临床上膀胱癌患者及泌尿系统良性疾病患者时常合并血尿，因此，尿液hCFHrp检测在临床应用中具有一定的局限性。本研究将进一步选择更接近临床实际工作中的样本，验证尿液中的血红蛋白、胆红素、清蛋白及尿酸等对尿液hCFHrp检测的影响程度，并通过选择不同的肿瘤标志物与尿液hCFHrp联合检测，以提高对膀胱癌诊断的准确性。