高效液相色谱法测水果罐头的四种合成着色剂

◎ 张志辉

（昭通市质量技术监督综合检测中心，云南 昭通 657000）

国家标准《食品安全国家标准 食品中合成着色剂》（GB 5009.35—2016）中规定，采用聚酰胺吸附法和液-液分配法测定合成着色剂，聚酰胺吸附法操作烦琐，液-液分配法只适用于赤藓红的测定[1]。本文采用高效液相色谱-二极管阵列多波长检测法检测柠檬黄、苋菜红、胭脂红、日落黄4种人工合成着色剂，此方法可大大提高检测灵敏度，并有效克服254 nm处的梯度洗脱时造成的基线漂移问题，提高了检测结果的准确性和精密度，简化操作步骤，缩短检验时间，提高检验效率，并保证检验结果的准确性。

1 材料与方法

1.1 仪器设备

高效液相色谱仪（LC20AB，岛津公司），配有二极管阵列检测器；电子天平0.1 mg（AL204、梅特勒-托利多）；匀浆机（IKA T25）；电子恒温水浴锅（HWS12、上海一恒）；超纯水机（Milli-Q Direct16）；3 000 r·min-1离心机（TGL16、长沙英泰）；0.45 μm水性过滤膜、固相萃取装置。

1.2 材料与试剂

水果罐头：苹果、樱桃、梨、桃，4个批次；标准溶液（中国计量研究院）：柠檬黄（批号：GBW（E）100001a）、苋菜红（批号：GBW（E）100002a）、日落黄（批号：GBW（E）100003a）、胭脂红（批号：GBW（E）100004a），浓度为0.5 mg·mL-1；分析纯类：无水乙醇、氨水、盐酸、乙酸铵；色谱纯类：甲醇；固相萃取柱。

1.3 试验方法

1.3.1 标液配制

精准量取0.5 mg·mL-1混标1 mL于10 mL容量瓶中，用纯水定容，得50 μg·mL-1标准储备液，取2.5 mL于25 mL容量瓶定容得5 μg·mL-1混标。取0.2 mL、0.4 mL、0.8 mL、2.0 mL、6.0 mL和10 mL于10 mL容量瓶定容，得 0.100 μg·mL-1、0.200 μg·mL-1、0.400 μg·mL-1、1.00 μg·mL-1、3.00 μg·mL-1和 5.00 μg·mL-1的标准梯度液。

1.3.2 色谱条件

流动相：A相为甲醇，B相为0.02 mol·L-1乙酸铵溶液；梯度洗脱设置详见表1。流速：1.0 mL·min-1；检测波长：柠檬黄428 nm、苋菜红521 nm、胭脂红509 nm、日落黄483 nm；色谱柱：Diamonsil-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；柱温：30 ℃；进样量：10 μL。

1.3.3 样品处理方法

将样品搅碎均匀，称取2 g样品（精确至0.000 1 g）放入离心管中，加10 mL无水乙醇-氨水溶液（7∶3），涡旋0.5 min后在3 000 r·min-1离心机离心10 min，上清液用玻璃漏斗过滤收集，剩余残渣再重复3次，收集滤液约40 mL，置于恒温水浴锅蒸发约2 mL。用2%的氨水调pH值为8，转移到固相萃取柱。甲醇和水预处理过，依次用3mL pH值为8的水和pH值为8的50%甲醇清洗萃取柱，丢弃全部流出液。再用10 mL盐酸-乙醇溶液（1∶1）将着色剂洗脱出萃取柱，收集洗脱滤液，氨水调节pH至7，80 ℃水浴蒸干，冷却后用50%甲醇定容到10 mL，用0.45 μm 滤膜过滤进样[2-8]。

2 结果与分析

2.1 试验结果

在1.3色谱条件下，标液过0.45 μm滤膜，进样10 μL，测得合成着色剂柠檬黄、苋菜红、胭脂红、日落黄保留时间分别为3.657 min、4.543 min、7.037 min、9.010 min。

根据进样色谱图和《食品安全国家标准 食品中合成着色剂的测定》（GB 5009.35—2016）中计算公式得到苹果、樱桃、梨和桃（2.032 3 g）中4种着色剂检测结果见表2。柠檬黄检出限为1.80 μg·mL-1、苋菜红检出限为 1.48 μg·mL-1、胭脂红检出限为 1.36 μg·mL-1、日落黄检出限为 0.20 μg·mL-1。

表2 水果罐头中4种合成着色剂检测结果表（单位：μg·mL-1）

2.2 加标回收率及精密度实验

在10 g糖水苹果中，加入适量低（10 μg·mL-1）、中（20 μg·mL-1）、高（30 μg·mL-1）浓度的标准溶液，平行添加3份，进行加标回收率试验。过滤后进行HPLC分析，实验数据详见表3。结果显示，4种合成着色剂的回收率均在91.9%及以上，萃取效率好。进行6次重复实验，相对标准偏差为0.59%～4.62%，均小于5%，精密度高。

表3 柠檬黄、芥菜红、胭脂红、日落黄加标回收率和相对偏差表（n=6）

3 结论

对水果罐头进行前处理时，若用GB/T 5009.35—2016里的聚酰胺吸附法，难以抽滤且会洗脱不完全。实验中加入无水乙醇-氨水溶液进行蒸发浓缩，不需吸附和解吸附，进行烦琐处理，可以减少操作过程中因温度、pH值、吸附及解吸附等对合成着色剂的破坏，从而降低损失。 选用无水乙醇-氨水溶液作为提取溶剂，提高了合成着色剂的溶出率，进而提高了回收率。本次实验研究发现水果罐头中合成着色剂在梯度洗脱条件下，通过降低有机相的比例，使保留时间延长，从而测定峰面积，使这4种色素得到很好的分离。在加标回收率实验中发现，浓度为20 μg·mL-1时回收率较高。采用水果罐头作研究对象，通过对样品前处理及梯度洗脱条件的优化，建立了一种测定合成着色剂的方法。此法简单、快捷、准确、回收率高，为检测大批量样品提供依据，能提高工作效率，节省检验时间。