PCR法对益生菌产品中双歧杆菌的鉴别

◎ 相红丽，雷红涛，黄惠英，付日留

（1.华南农业大学 食品学院，广东 广州 510642；2.合生元（广州）健康产品有限公司，广东 广州 510663）

益生菌是通过定殖在人体内改变宿主某一部位菌群组成的一类有益的活性微生物。通过调节宿主系统免疫功能或通过调节肠道内菌群平衡，起到促进营养吸收保持肠道健康的作用，被临床确认主要功效有：调节肠道菌群[1]、提高免疫力[2]、促进营养物质合成和矿物质的吸收[3]、治疗肠炎[4-5]以及抗肿瘤[6-7]。近几十年来，随着益生菌产品的健康功效被证明，益生菌产品受到广泛关注[8-9]，被广泛应用[10]到食品、保健食品和药品原料中[11-14]。然而，有调查发现一些商业益生菌产品的标识准确性存在问题，包括分类不准确、标识的菌种缺失、添加未申报的菌种等。益生菌产品因为菌株的差异，有益功效也不尽相同[15]，确认益生菌菌株及其活性是确保益生菌产品质量的关键。

双歧杆菌的鉴别主要以双歧杆菌的生物学特性为基础，利用分离培养技术[16-18]、形态鉴别或在培养基中添加显色成分，通过染色试验进行鉴别[19]，这些方法操作简单，但特异性差，受操作人员影响较大[20]。以分子生物学为基础的PCR检测方法，因其准确、快速、敏感、可靠及分辨率高的特点，在食品的鉴定中有较多应用[21-23]，食源性病原体[24]和鉴别污染来源也有应用PCR技术[25-26]，欧盟关于转基因生物检测的黄金标准检测方法也以PCR分析方法为基础[27]。PCR鉴别方法在益生菌和双歧杆菌的鉴别检测中也取得了长足的进展，并且发现实时荧光PCR方法对食品中双歧杆菌的检测也有较好的准确性和可靠性[28]。

本研究主要以PCR技术为基础，利用Primer Premier 6软件进行引物设计确定两歧双歧杆菌与婴儿双歧杆菌共存情况下的特异性引物，特异性引物在PCR体系和反应条件下对双歧杆菌DNA进行扩增，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳，并在128 bp处检查凝胶电泳的荧光条带情况，通过显示长度辨别，确认双歧鉴别产物。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

iQTM SYBR® Green Supermix，美国 Bio-Rad公司；PCR引物，北京擎科生物科技有限公司；滤芯、移液枪头、1.5 mL/2.0 mL离心管、微量移液器，德国艾本德Eppendorf；琼脂糖，Sigma-aldrich西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司；96孔qPCR板，英国Grant仪器公司；QIAamp® PowerFecal® Pro DNA Kit提取试剂盒，德国QIAGEN公司；DNA梯度标准品，Thermo赛默飞。

漩涡振荡器，德国IKA；小型高速离心机，英国Grant仪器公司；电泳槽、凝胶电泳呈现系统，美国Bro-Rad公司；超纯水机，Milipore上海；NanoDrop 2000c超微紫外分光光度仪，Thermo赛默飞；普通PCR仪、qPCR仪，美国Bio-Rad公司；生物安全柜，新加坡ESCO。

1.2 主要溶液

1%琼脂糖凝胶配制：0.5 g琼脂粉溶解到50 mL 1×TAE缓冲液，并加入5 μL DNA染色剂）。Mastermix溶液配制：将Premix Tag/ iQTM SYBR® Green Supermix充分解冻并旋涡振荡混匀，参照对应的反应体系配制Mastermix溶液。

1.3 实验方法

1.3.1 引物设计

按照产品中添加的婴儿双歧杆菌、两歧双歧杆菌和乳酸杆菌的类别，在NCBI数据库中查找两歧双歧杆菌和婴儿双歧杆菌的16SrRNA序列信息，使用软件DNA MAN对比找出序列的同源性，进而找到两歧双歧杆菌和婴儿双歧杆菌的16SrRNA基因的保守区。依据两种双歧杆菌的16SrRNA特异性基因序列并参照国外文献[29-31]，利用Primer Premier 6软件进行引物设计，找到最合适两歧双歧杆菌和婴儿双歧杆菌的种属特异性引物。实时荧光定量PCR引物的序列[32-33]。上游引物 BifF1：5’-TCGCGTCYGGTGTGAAAG-3’， 下游引物BifR1：5’-GGTGTTCTTCCCGATATCTACA-3’，PCR产物长度128 bp。

1.3.2 DNA提取

采用QIAamp Power Fecal Pro粪便DNA提取试剂盒并按照说明，对两歧双歧杆菌、婴儿双歧杆菌和乳酸杆菌菌粉原料进行DNA提取，提取好后备用。

1.3.3 引物特异性评价

乳酸杆菌、两歧双歧杆菌、婴儿双歧杆菌菌粉原料DNA提取物先稀释至50 ng·μL-1进行均一化，然后再稀释至5 ng·μL-1作为工作液，最后稀释至1 ng·μL-1，在PCR反应体系中加入与模板DNA等体积的水作为空白对照，设定样品在96孔板的位置。用微量移液器移取20 μL mastermix至96孔板的孔内，然后在各反应孔内加入5 μL DNA模板用实时荧光PCR板专用封板膜封板。菌粉原料DNA提取物使用双歧杆菌属水平特异性引物，按实时荧光定量PCR反应体系（iQTM SYBR® Green Supermix染料，12.5 μL；上游引物，1.25 μL；下游引物，1.25 μL；分子级别无菌水，5.0 μL，DNA 模板，5.0 μL）和荧光定量PCR反应程序（95 ℃，预变性3 min；95 ℃，变性30 s；退火60 ℃，延伸30 s；循环40次，95 ℃，1 min；55 ℃，1 min终延伸）对DNA进行实时荧光PCR扩增实验，观察扩增曲线和Ct值。

1.4 PCR鉴别反应体系的构建

1.4.1 PCR反应体系的设计

婴儿双歧杆菌、两歧双歧杆菌和乳酸杆菌菌粉原料DNA提取物，加入双歧杆菌属水平特异性引物，按照反应体系（Premix Taq™酶，25 μL；上游引物，2.5 μL；下游引物，2.5 μL；分子级别无菌水，15 μL，DNA模板，5.0 μL）、PCR反应程序（95 ℃，预变性3 min；95 ℃，变性30 s；60 ℃，延伸30 s；循环40次，72 ℃，终延伸10 min）对DNA进行PCR扩增实验。

1.4.2 PCR产物琼脂糖凝胶电泳

上述菌粉原料DNA扩增产物稀释至50 ng·μL-1进行均一化，然后再稀释至5 ng·μL-1作为工作液，最后稀释至1 ng·μL-1，在PCR反应体系中加入与模板DNA等体积的水作为空白对照，系统设定样品在96孔板的位置。用微量移液器移取20 μL MasterMix溶液至96孔板的孔内，然后在各反应孔内加入5 μL DNA模板用实时荧光PCR板专用封板膜封板。样品进行琼脂糖凝胶电泳，吸取5 μL的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳（130 V×35 min）。使用凝胶成像系统对电泳条带进行分析，拍照判断菌落属性。

1.5 乳酸杆菌、两歧双歧杆菌、婴儿双歧杆菌原料菌株鉴别

将乳酸杆菌、两歧双歧杆菌、婴儿双歧杆菌原料，分别按照传统培养法接种培养出生长完好的菌落，按照上述PCR反应体系和条件进行扩增。扩增后产品按照上述方法进行凝胶电泳，观察荧光条带的情况。

2 结果与分析

2.1 引物特异性评

扩增曲线和Ct值如图1所示。由图可知，婴儿双歧杆菌菌株扩增曲线的Ct值为12.48，两歧双歧杆菌菌株扩增曲线的Ct值为13.14。这说明这对特异性引物可以很好的对婴儿双歧杆菌菌株、两歧双歧杆菌菌株这两株菌进行qPCR扩增。乳酸杆菌菌株扩增曲线的Ct值为32.23（一般认为样品的Ct值超过30，就意味着qPCR对此样品没有扩增作用），这说明这对引物对乳酸杆菌菌株没有扩增作用。

图1 乳酸杆菌、两歧双歧杆菌、婴儿双歧杆菌DNA扩增曲线图

按照引物序列计算PCR扩增产物的长度约为128 bp，凝胶电泳图如图2，由图可知婴儿双歧杆菌、两歧双歧杆菌菌株扩增得到很明显的条带，而乳酸杆菌菌株没有得到条带，说明该引物可以对婴儿双歧杆菌、两歧双歧杆菌进行鉴别，无法对乳酸杆菌鉴别。

图2 菌粉DNA扩增产物凝胶电泳荧光条带图

2.2 PCR鉴别体系的建立

乳酸杆菌、两歧双歧杆菌、婴儿双歧杆菌原料培养出的菌落PCR产物凝胶电泳图如图3，由图3可知特异性引物可以很好地对原料中两歧双歧杆菌、婴儿双歧杆菌进行鉴别。

图3 菌落PCR产物凝胶电泳荧光鉴别图

2.3 复合型益生菌产品中的双歧杆菌鉴别

在双歧杆菌选择性培养基上对复合型益生菌样品进行培养，选取培养基中益生菌产品生长的完好菌落，按照以上方法进行PCR扩增和鉴别。凝胶电泳荧光条带显示均在128 bp左右的长度，说明该方法可以对益生菌产品中的双歧杆菌进行鉴别。

3 结论

本文成功的设计特异性引物，并验证了引物可以对婴儿双歧杆菌和两歧双歧杆菌进行扩增，但对乳酸杆菌没有扩增，并确立了适合婴儿双歧杆菌和两歧双歧杆菌的PCR反应体系和条件，由此，可以实现在婴儿双歧杆菌、两歧双歧杆菌和乳酸杆菌共存时，对复合型益生菌产品中双歧杆菌的鉴别。