性病高危人群阴道乳酸杆菌的调查研究

王 聪，白 丽*

（1.大理学院基础医学院，云南大理 671000；2.云南省昆虫生物医药研发重点实验室，云南大理 671000）

性病高危人群阴道乳酸杆菌的调查研究

王 聪1，2，白 丽1，2*

（1.大理学院基础医学院，云南大理 671000；2.云南省昆虫生物医药研发重点实验室，云南大理 671000）

目的：比较HIV性途径感染女性高危人群及健康体检人群阴道乳酸杆菌的检出率及具有防御功能的乳酸杆菌检出率，对高危组阴道防御能力做出正确评估，为更好地实施预防治疗及干预活动提供理论基础。方法：选择71例健康体检者，120例性工作者阴道分泌物进行乳酸杆菌阳性率及具有防御功能的乳酸杆菌阳性率检测，确定高危人群组乳酸杆菌分布及防御能力。结果：高危人群组乳酸杆菌的检出率及具有防御能力的乳酸杆菌检出率均低于健康人群，经χ2检验，差异有统计学意义。结论：性病的易感性与阴道的微环境的破坏，尤其乳酸杆菌数量的减少及防御能力的降低有着至关重要的关系。

性传播疾病；高危人群；乳酸杆菌

性传播疾病（sexually transmitted disease，STD），是通过感染者经性接触传播给未感染者，有20余种，包括至今仍无有效疗法的致死性传染病AIDS，性工作者是其传播的主要桥梁〔1-2〕。性病病原体存在于感染者的生殖道分泌物中，性接触时病原体可通过破损处侵入血液而感染，如阴道内存在抑制性病病原体活性的因素可能会减少性病的感染及传播，这种因素存在与否由阴道的防御系统决定的〔3-5〕。阴道防御系统是由阴道内微生态菌群、阴道免疫系统及黏膜共同组成，其中阴道内微生态的平衡在防御过程中起了主要作用。研究发现健康妇女阴道正常菌群中以乳酸杆菌（Lactobacillus）占主导地位，是最重要的优势菌。其可通过产酸、H2O2、细菌素等抗微生物物质来抑制阴道病原微生物的入侵，维持阴道微生态平衡、抵抗性病及生殖道感染〔6-8〕。为了了解性病高危人群阴道防御情况，我们对其阴道乳酸杆菌的有无及功能进行调查。现将结果报道如下。

1 材料

1.1 试验材料 菌株：金黄色葡萄球菌标准菌株，大肠埃希菌标准菌株，铜绿假单胞菌，乳酸杆菌临床分离株。细胞株：Hela细胞。

1.2 仪器设备及试剂 恒温培养箱、厌氧培养系统、pH检测仪、CO2培养箱、MH培养基、MRS培养基、细胞培养液等。

2 方法

2.1 乳酸杆菌检出率 分别取性病高危人群及健康体检者阴道分泌物，用涂布法分离出分泌物中的细菌，对不同菌落进行革兰染色并镜检，根据菌落及镜下形态将疑似乳酸杆菌接种于乳酸杆菌选择培养基MRS培养基，生长者为乳酸杆菌。

2.2 乳酸杆菌功能的检测

2.2.1 产酸功能检测 将乳酸杆菌接种于pH值为7的MRS培养基，厌氧培养48 h，通过pH测试仪检测上清液的pH值，了解乳酸杆菌的产酸情况。

2.2.2 产H2O2功能的检测 将乳酸杆菌分区接种于含有一定量TMB（3，3'，5，5'-四甲基联苯胺）-HRP（辣根过氧化物酶）的MRS平板上，37℃厌氧培养48 h，置于有氧环境中30 min后观察颜色变化。产H2O2的乳酸杆菌菌落可在有氧存在的情况下，被培养基中的HRP催化，与底物TMB发生反应，呈现蓝色。

2.2.3 黏附功能的检测 首先复苏、转接及处理黏附用细胞（Hela细胞）。将乳酸杆菌用PBS洗涤3遍（8 000 r/min，10 min）。用无抗生素和小牛血清的RPMI-1640细胞培养液调整细菌浓度为5×108个/mL。在细胞培养板每孔中放置一片盖玻片，向细胞培养板中每孔加入1 mL上述RPMI-1640细胞培养液，再加入1 mL乳酸杆菌悬浮液。轻柔晃动细胞培养板，使乳酸杆菌分散均匀，置于37℃，5%CO2培养箱中培养2.5 h。取出盖玻片，并用PBS洗涤3遍，自然干燥后瑞士染色，油镜下观察细菌在Hela细胞上的黏附情况。

2.2.4 拮抗功能的检测 用双层平板法对乳酸杆菌抑制病原菌（本实验选用金黄色葡萄球菌，大肠埃希菌及铜绿假单胞菌3种病原菌的标准菌株）的能力进行筛选。用生理盐水悬浮菌体并调整细菌浓度为6×108个/mL，点种于薄MRS固体培养基，厌氧培养，37℃培养1 h。用标准比浊管进行比浊，制备0.5麦氏单位浓度的致病菌悬液。按菌液：MH半固体琼脂培养基=1∶9的比例在40℃进行充分混合，将约10 mL混合液倒入培养，使其均匀分布，37℃培养12 h后观察结果。

2.3 统计学分析 采用EXCEL软件和SPSS17.0统计软件进行数据的分析处理。

3 结果

3.1 两组人群乳酸杆菌检出率 性病高危人群组乳酸杆菌阳性率为22.5%，健康对照组乳酸杆菌阳性率76.1%，经χ2检验P＜0.05，差异有统计学意义。见表1。

表1 两组人群阴道乳酸杆菌阳性率比较

3.2 两组人群乳酸杆菌产酸能力的比较 性病高危人群组乳酸杆菌培养上清液pH值中位数高于健康对照组，经秩和检验P=0.000＜0.05，差异有统计学意义。性病高危组上清液pH≤4.6占0%，pH＞5的占77.8%，介于两者之间的占22.2%。健康阴道pH≤4.6占50%，pH＞5占22.2%，介于两者之间的占27.8%。显示高危组乳酸杆菌培养上清液pH值高于健康组，经卡方检验P＜0.05，差异有统计学意义。产酸乳酸杆菌的减少进一步加重了高危人群阴道微环境被破坏。见表2。

3.3 两组人群乳酸杆菌产H2O2能力比较 性病高危人群组产H2O2乳酸杆菌检测率为40.7%，健康对照组产H2O2乳酸杆菌检测率为77.8%，经χ2检验P＜0.05，差异有统计学意义。可见高危组产H2O2乳酸杆菌检测率明显低于健康组。见表3。

3.4 两组人群乳酸杆菌黏附能力比较 性病高危人群组具有黏附功能的乳酸杆菌检测率为29.6%，健康对照组具有黏附功能的乳酸杆菌检测率为85.2%，经χ2检验P＜0.05，差异有统计学意义。可见高危组具有黏附功能的乳酸杆菌检测率明显低于健康组。见表4。

表2 两组人群乳酸杆菌产酸功能比较

表3 两组人群阴道乳酸杆菌产H2O2功能比较

表4 两组人群阴道乳酸杆菌黏附能力比较

3.5 两组人群乳酸杆菌拮抗能力比较 性病高危人群组对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌有拮抗作用的乳酸杆菌检出率分别为63%、44.4%、55.6%。健康对照组对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌有拮抗作用的乳酸杆菌检出率分别为88.9%、83.3%、85.2%。经χ2检验P＜0.05，差异有统计学意义。分别对两组人群分离的乳酸杆菌拮抗3种病原菌能力进行两两比较，P＞0.05，差异无统计学意义。可见高危组具有黏附功能的乳酸杆菌检测率明显低于健康组，而乳酸杆菌对病原菌的拮抗能力差异无统计学意义。见表5-7。

4 讨论

乳酸杆菌是健康妇女阴道内最重要的优势菌属，乳酸杆菌数量减少甚至缺失是阴道微生态失衡的重要标志之一，随之而来的是阴道炎症及性病的发生率增加。性病高危组阴道乳酸杆菌检出率明显低于健康组，可见乳酸杆菌的缺失是此组人群易患性病及生殖道炎症的重要原因之一。乳酸杆菌主要就是通过它的黏附、产酸、产H2O2及拮抗作用对阴道进行保护，其功能的好坏直接影响阴道防御能力的高低。本实验通过检测这些功能，以判断性病高危组的阴道防御功能。本实验通过Hela细胞模型（Hela细胞是阴道宫颈癌细胞，与阴道上皮细胞（VEC）具有较高的同源性，其表面抗体及组成与VEC具有较大的相似性，可以基本反映细菌对于VEC的黏附情况）。对阴道源乳酸杆菌的黏附效果进行了筛选。性病高危组中具有黏附能力乳酸杆菌检出率为29.6%明显低于对照组85.2%，经检验差异有统计学意义。而致病菌感染阴道的首先步骤是入侵黏膜系统，有良好黏附能力的乳酸杆菌的黏附作用在该过程中起到了重要的防御作用，当病原菌入侵时，乳酸杆菌首先和病原菌竞争VEC表面的受体，取代病原菌与受体结合，阻止病原菌的初始黏附。随后和这些病原菌发生凝集反应，再通过产生酸、H2O2或细菌素样等杀菌物质来杀灭病原菌。本实验对两种人群阴道乳酸杆菌产生以上杀菌物质的能力进行了调查。发现高危组人群阴道乳酸杆菌产酸能力明显低于对照组。有研究表明大多数病原菌甚至HIV对酸较敏感，乳酸杆菌可以通过分解乳酸降低阴道酸碱度，抑制杀伤病原菌，减少性病的发生〔9-11〕。同时研究发现高危组阴道产H2O2的乳酸杆菌阳性率40.7%明显低于对照组77.8%。而乳酸杆菌产生的H2O2可形成超氧化阴离子形成破坏性氢氧游离基（·OH），对病原菌的细胞壁的进行强氧化作用及破坏核酸及细胞内蛋白质，从而杀伤病原菌。有研究发现乳酸杆菌产生的H2O2对引起泌尿生殖道的感染的病原菌如加得纳菌、淋球菌、念珠菌等有重要的抵抗作用〔12〕。此外乳酸杆菌还可以通过在代谢过程中产生的一些抑菌活性的物质如细菌素，抑制及杀伤病原菌，保护阴道微环境，降低性病的感染及传播。而本实验中高危人群抑制和杀伤病原菌的能力明显低于对照组，说明高危人群阴道乳酸杆菌可产生抑菌物质的能力较低，阴道的防御能力也较低。

表5 两组人群乳酸杆菌拮抗功能比较

表6 高危组乳酸杆菌对3种细菌拮抗功能比较

表7 健康组乳酸杆菌对3种细菌拮抗功能比较

乳酸杆菌通过以上的一种或者几种机制来对致病菌起到拮抗作用。从实验的结果可以看出，性病高危组具有黏附、产酸、产H2O2、产抑菌物质功能的乳酸杆菌检出率明显低于健康组，高危组阴道的防御功能明显低于健康组，应进行相应的预防。而防御功能较好的乳酸杆菌菌株类型生长特性、抑菌作用以及抗菌谱和体内抗菌效果还有待于进一步研究。

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*通讯作者：白丽，教授，博士.

（责任编辑 李 杨）

Primary Study on Lactobacillus from vaginal of High-risk Females in STD

WANG Cong1，2，BAI Li1，2*
（1.Pre-Clinical College，Dali University，Dali，Yunnan 671000，China；2.Yunnan Provincial Key Laboratory of Entomological Biopharmaceutical R&D，Dali，Yunnan 671000，China）

Objective：To compare the quantity and the protection function of Lactobacillus in the vagina between the high-risk females in STD and the healthy group，and evaluate its defense capability，in order to provide a theoretical basis for implementing the prevention and treatment interventions.Methods：71 healthy women and 120 high-risk females in STD were selected.The rate of vaginal Lactobacilli and its function of producing the organic acids，hydrogen peroxide（H2O2），and other antimicrobial substances in vaginal secretions were detected to quantify the number and defensive ability of Lactobacilli of high risk population.Results：The positive rate of Lactobacillus，and the protection of the high-risk females in STD were lower than the healthy group.Conclusion：Susceptibility of STD has an important relationship with the damage of the micro environment of vaginal，especially the reduction of the amount and defense ability of Lactobacillus

STD；high risk group；Lactobacillus

R512.91

A

1672-2345（2014）04-0018-04

10.3969/j.issn.1672-2345.2014.04.006

“十一五”国家传染病重大专项资助项目（2008ZX10001-015）；大理学院青年教师科研基金资助项目（KYQN201109）

2013-12-22

2014-01-03

王聪，助理实验师，主要从事感染与免疫学研究.