TGF-β1、Caspase-3和WT1在肾活检肾小球肾炎组织中的表达及临床病理意义

张 弢，张 雨，李小丽，何敏华

（大理学院附属医院，云南大理 671000）

TGF-β1、Caspase-3和WT1在肾活检肾小球肾炎组织中的表达及临床病理意义

张 弢，张 雨，李小丽，何敏华*

（大理学院附属医院，云南大理 671000）

目的：探讨转化生长因子β1（TGF-β1）、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（Caspase-3）及肾母细胞瘤抑癌基因蛋白（WT1）在肾活检肾小球肾炎组织中的表达及其意义。方法：采用Envision法对40例肾小球肾炎组织及7例对照组肾组织进行TGF-β1、Caspase-3和WT1免疫组织化学染色标记、分析。结果：TGF-β1、Caspase-3、WT1在各种肾炎组织中均有表达，各实验组与对照组差异有统计学意义（P＜0.05）。TGF-β1在系膜增生性肾小球肾炎组的表达明显低于膜性肾病组（t=-4.131，P=0.002）；Caspase-3在各组别中其表达差异无统计学意义；WT1在大量高蛋白尿组表达低于非大量蛋白尿组（t=-2.130，P=0.046）；其余组别差异无统计学意义。WT1的低表达与TGF-β1、Caspase-3的高表达相关。结论：TGF-β1、Caspase-3表达的上调及WT1表达的下调与肾病理改变密切相关，蛋白尿和足细胞减少可能是肾脏病进展的预测因子及肾小球硬化的原因。

肾活检；转化生长因子β1；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3；肾母细胞瘤基因蛋白；蛋白尿；免疫组织化学

终末期肾脏病（end-stage renal disease，ESRD）是各种逐渐进展肾脏病和肾损害的最终环节，病程中囊括了庞大的临床症群，其死亡率和发病率在全世界范围内不断攀升，对医疗保险系统带来严重冲击〔1-2〕。在我国肾小球肾炎是导致终末期肾病最常见的原因〔2〕，肾穿刺活组织检查（简称肾活检）正是确定肾脏疾病诊断、治疗及预后评估的重要手段。随着近年来分子病理学技术在肾脏病理学的渗透，对肾脏疾病的病因、发病机制等提供重要信息。研究〔3〕表明转化生长因子β1（TGF-β1）参与肾血管疾病进展，炎症细胞浸润，肾小球硬化及肾间质纤维化。半氨酸天冬氨酸蛋白酶3（Caspase-3）是细胞凋亡的关键执行者，动物实验〔4〕表明其表达水平与各种肾小球、肾小管及肾间质细胞的凋亡、炎症、纤维化密切相关；肾母细胞瘤抑癌基因蛋白（WT1）的表达减少反映了足细胞数量的减少及肾小球滤过屏障的受损，导致了疾病进展及肾小球的硬化〔5〕。本实验旨在对肾活检患者TGF-β1、Caspase-3、WT1表达水平的检测和分析，探讨处于发展早期的肾小球疾病损伤机制与病理类型及临床表现的关系。

1 材料和方法

1.1 研究对象

1.1.1 标本来源 选取大理学院附属医院肾内科2010年3月至2013年3月期间资料完整，符合肾活检适应症〔6〕137-139，且为首次肾活检患者的肾组织标本，共40例，男性22例，女18例，年龄15~65岁，中位年龄40岁。病理诊断为22例系膜增生性肾小球肾炎（其中7例为IgA肾病，15例非IgA肾病），13例膜性肾病，2例微小病变型肾病，1例局灶节段性肾小球硬化，1例狼疮性肾炎，1例糖尿病肾病。并收集患者首次肾活检时年龄、性别、病程、血肌酐（SCr）、24小时尿蛋白定量值（TUpr）、血浆白蛋白值（Alb）。对照组选取自肾肿瘤及多囊肾患者远离肿瘤及多囊肾囊壁部分的肾组织。

1.1.2 研究分组 病理分组：病理诊断类型分组：40例肾活检患者分为系膜增生性肾小球肾炎（MsPGN）组及膜性肾病（MN）组。肾小球滤过率（GFR）分组：采用MDRD公式计算评估所有患者GFR水平，分为肾损害组和非肾损害组。蛋白尿分组：根据TUpr标准分为大量蛋白尿组和非大量蛋白尿组。见表1。

1.2 主要试剂 TGF-β1兔抗人多克隆抗体（ab53169），工作浓度1∶200，Caspase-3兔抗人多克隆抗体（ab4053），工作浓度1∶700，均购自美国abcam公司；WT1鼠抗人单克隆抗体（克隆号6F-H2），工作浓度1∶100，购自丹麦Dako公司；二抗为通用型Envision套盒（K500711），DAB试剂盒（K346711）均购自于基因科技（上海）有限公司。

表1 不同分组的一般临床资料

1.3 方法及结果判定 采用免疫组化Envision二步法检测，实验步骤严格按照试剂盒操作说明进行。TGF-β1、Caspase-3阳性表达位于细胞膜和细胞质，WT1阳性表达位于细胞核，均表现为棕黄色或黄色颗粒。每张切片在高倍镜下（400倍）随机选取5个视野，将图像采集入计算机，应用Image-Pro Plus（IPP）6.0彩色图像处理系统半定量分析测定感兴趣区域〔7〕TGF-β1、Caspase-3、WT1的积分光密度（IOD），取平均值反映标本相关指标的表达量。

1.4 统计学方法 应用SPSS 19.0统计软件进行统计分析，参数以均数±标准差）表示，计量资料采用t检验，计数资料采用Fisher’s精确检验，多因素影响分析采用多重线性回归分析（Backward法）。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同分组首次肾活检患者病理类型、临床资料情况比较 采用两独立样本t检验对40例首次肾活检患者年龄、性别、病程在所有研究分组中显示差异无统计学意义（P＞0.05）。病理分组与GFR分组中TUpr值、Alb值差异无统计学意义（P＞0.05）；病理类型分组与尿蛋白分组中GFR值差异无统计学意义（P＞0.05）；GFR分组和尿蛋白分组中病理类型（MsPGN vs MN）予Fisher’s精确检验，结果显示差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

2.2 TGF-β1、Caspase-3、WT1在不同组别及对照组的表达 TGF-β1、Caspase-3、WT1在所有肾组织标本中均有表达，TGF-β1、Caspase-3主要表达在肾小球和肾小管细胞的胞膜和胞质，染色较强且均一，少量表达在肾小管腔内，染色均一性差。WT1则仅表达在肾小球上皮细胞的细胞核，染色较深。

40例病例组与7例对照组在TGF-β1、Caspase-3、WT1的表达（IOD值，下同）差异均有统计学意义（t= 6.256，P=0.000；t=4.744，P=0.000；t=-3.05，P=0.022）。TGF-β1的表达：MsPGN组＜MN组（t=-4.131，P= 0.002）；其余分组差异无统计学意义。Caspase-3的表达在3个分组中差异无统计学意义。WT1的表达：大量蛋白尿组＜非蛋白尿组（t=-2.130，P=0.046）；其余分组差异无统计学意义。见表2及封三图1。

表2 TGF-β1、Caspase-3、WT1在不同分组及正常对照组的表达

采用多重线性回归（Backward法）对TGF-β1、Caspase-3、WT1的表达强度和相关临床资料建立多重线性回归方程（数据资料均经过标准化处理）。y^1=2.393×10-16-0.373X1-0.317X2+0.245X3+0.163X4（y1：TGF-β1IOD值；X1：TUpr值；X2：WT1 IOD值；X3：病理类型；X4：Caspase-3 IOD值）；y^2=-6.883×10-17-0.387X1-0.325X2-0.290X3+0.160X4-0.086X5+ 0.058X6-0.023X7（y2：WT1IOD值；X1：年龄；X2：TUpr值；X3：TGF-β1IOD值；X4：Alb值；X5：GFR值；X6：性别；X7：Caspase-3 IOD值）。Caspase-3未能建立回归方程（P＞0.05）。结果显示TUpr值对TGF-β1和Caspase-3的表达作用明显；TGF-β1和WT1表达水平互为负相关影响因素，后者对前者表达影响更大；Caspase-3表达对两者有影响但较弱；年龄、性别、TUpr值、GFR值、Alb值这些临床指标对WT1更易造成影响。

3 讨论

ESRD患者在我国逐年增长，已成为常见的高患病率及致死率疾病。肾活检已成为多数大型医院的常规检查项目，其技术及诊断水平不断发展，但是仍没有一种令人满意的肾小球疾病分类法〔6〕276可以将病因、发病机制、组织形态学改变到临床综合征一一对应，且能指导治疗。本研究中相关分组的资料对比的差异多无统计学意义即印证了上述观点。

本研究发现TGF-β1在13例膜性肾病的表达（2.784±1.068）高于22例系膜增生性肾小球肾炎（1.099±0.488），且两者均高于正常对照组（0.342± 0.242）。提示TGF-β1表达可能与病理类型相关。相关研究鲜见报道，仅早年Iwano M等〔8〕发现与正常肾组织相比，TGF-β1表达差异由大至小依次为糖尿病肾病、中度系膜增生性肾小球肾炎及狼疮性肾炎，提示系膜基质增多的病理改变与TGF-β1表达有关。TGF-β1作为重要调节因子能引起肾组织结构改变，其诱导了足细胞减少、系膜增宽、细胞外基质合成，内皮细胞间质样转变致肾小球硬化；肾小管纤维化增生致小管细胞缺失及间质纤维化〔3〕。

Caspase-3是细胞凋亡的关键执行者〔4〕，本研究中虽然其在病例组的表达显著高于对照组，但不乏轻度病理改变的个例表达水平与对照组持平甚至更低，且研究分组中未显示表达差异。王晨静等〔9〕发现Caspase-3在IgA肾病Ⅰ级（Haas分级）的表达显著低于IgA肾病Ⅱ~Ⅴ级，且在IgA肾病Ⅱ~Ⅴ级中表达无差异；而Bcl-2的表达在IgA肾病Ⅲ~Ⅴ级明显高于IgA肾病Ⅰ~Ⅱ级，Bcl-2的表达的增强抑制Caspase-3在较高分级IgA肾病的表达。Yang B等〔10〕在动物实验中也阐明Caspase-3的表达受Bax/Bcl-2平衡影响。这些提示Caspase-3在肾脏病进程早期受到多因素的调节，细胞凋亡和增殖在病程早期能维持平衡。

足细胞是近年来肾脏病研究的热点，本研究发现其标志物WT1仅表达在肾小球上皮细胞的细胞核，正常组的表达显著高于病例组，在蛋白尿分组中非大量蛋白尿组的表达（2.818±1.162）高于大量蛋白尿组（1.860±0.896），推测足细胞损伤可能引起WT1表达降低，而尿蛋白既是足细胞损伤的临床表现又同时扮演了损伤因素的角色。Schumacher VA等〔11〕研究提示WT1在肾小球滤过屏障的维持中起核心作用，并在足细胞与内皮细胞之间起到交互调节作用，缺乏滤过屏障而导致的难治性的大量蛋白尿将引起ESRD。Peired A等〔11-12〕在动物模型中发现蛋白尿阻止了肾祖细胞向足细胞的分化，而视黄酸具有保护作用，血浆白蛋白是其载体，提示蛋白尿与足细胞损伤并不是简单的剂量依赖关系，它不仅是病程发展的标准物也是肾小球硬化的原因。

在多重线性回归模型中我们发现TUpr值对TGF-β1和WT1的表达几乎占首要地位，提示蛋白尿可能是慢性肾脏病（CKD）进展的重要影响因素。Gorriz JL等〔13〕认为蛋白尿在CKD进展中是最精确的肾病结局及死亡率的预测因子。本研究提示TGF-β1和WT1表达呈负相关。研究〔5，14〕证实两者有互相抑制调节的作用而TGF-β1体内试验致足细胞凋亡率低〔3〕，使我们大胆推测WT1对TGF-β1表达抑制作用更为明显，而TGF-β1对足细胞损伤的作用途径更广泛。Rule AD等〔15〕发现在健康人群的中年龄与肾小球硬化有显著相关性，年龄相关的肾小球硬化有独特的肾脏病理学改变，且与其它导致肾小球硬化因素（CKD危险因素、尿蛋白、GFR水平）无相关性。该结论与本研究相关结果存在一致性且互为补充。

Tunçdemir M等〔4〕发现足细胞数量的减少是疾病早期的表现，其导致了蛋白尿、肾小球基质的增多、系膜细胞增生、GBM膜增厚、肾小球上皮细胞的凋亡等肾小球损伤，体现在TGF-β1、Caspase-3高表达与WT1低表达。这与本研究在相同指标的表达相吻合。Tunçdemir M等研究还提出血管紧张素Ⅱ会促进肾小球上皮细胞的凋亡，并发现厄贝沙坦治疗干预后的动物实验组WT1表达的上调，Caspase-3和TGF-β1表达下调。所以，AT1受体拮抗剂（ARB）或血管紧张素转换酶抑制剂（ACEI）对TGF-β1、Caspase-3、WT1的表达的影响说明其产生肾脏保护作用的分子机制是多途径的，例如抑制了肾小球上皮细胞的凋亡，减少肾小球基质的产生，维持足细胞数量及肾小球滤过屏障功能等。临床中存在ARB和ACEI类药物是降压药的主体印象，其减少蛋白尿原因也是对肾血液流变学的影响即降低肾小球内压。认为此类药对症是基本，如患者存在蛋白尿且合并高血压才是最佳适应征。而减少肾小球肾炎患者的蛋白尿临床医生仍多寄希望于糖皮质激素和免疫抑制剂的应用。通过本研究和上述动物实验的结论ARB和ACEI类药物临床应用价值明显且更广泛，尤其是在慢性肾小球肾炎疾病的早期应作为首选的基础药物。

总之，在肾小球组织病理改变与TGF-β1、Caspase-3、WT1的表达有关。TGF-β1、Caspase-3在显著病理改变的肾小球疾病中表达增高而WT1表达下降。WT1与TGF-β1表达互相抑制。重要指标尿蛋白和足细胞损伤标志物WT1可能是肾小球疾病的始动及预测因子。TGF-β1、Caspase-3、WT1对发展至ESRD的早期肾小球疾病可能起协同作用。以首次肾活检时间作为横断面，对三者表达水平的研究，对大量临床有肾活检适应症的患者诊断及治疗提供新的思路。

〔1〕ROBERT N，FOLEY，ALLAN J，et al.The USRDS：What You Need to Know about What It Can and Can't Tell Us about ESRD〔J〕.Clin J Am Soc Nephrol，2013，8（5）：845-851.

〔2〕LIU Z H.Nephrology in China〔J〕.Nat Rev Nephrol，2013，9（9）：523-528.

〔3〕LOPEZ-HERNANDEZ F J，LOPEZ-NOVOA J M.Role of TGF-β in chronic kidney disease：an integration of tubular，glomerular and vascular effects〔J〕.Cell Tissue Res，2012，347（1）：141-154.

〔4〕TUNCDEMIR M，ÖATURK M.The effects of angiotensin-II receptor blockers on podocyte damage and glomerular apoptosis in a rat model of experimental streptozotocininduced diabetic nephropathy〔J〕.Acta histochemica，2011，113（8）：826-832.

〔5〕SAKAIRI T，ADE Y，KOPP J B.TGF-beta1 reduces Wilms'tumor suppressor gene expression in podocytes〔J〕. Nephrol Dial Transplant，2011，26（9）：2746-2752.

〔6〕黎磊石，刘志红.中国肾脏病学〔M〕.北京：人民军医出版社，2008：8.

〔7〕JENKINS J，BRODSKY S V，SATOSKAR A A，et al.The relevance of periglomerular fibrosis in the evaluation of routine needle core renal biopsies〔J〕.Arch pathol lab med，2011，135（1）：117-122.

〔8〕IWANO M，AKAI Y，FUJII Y，et al.Intraglomerular expression of transforming growth factor-beta 1（TGF‐β1）mRNA in patients with glomerulonephritis：quantitative analysis by competitive polymerase chain reaction〔J〕.Clin Exp Immunol 1994，97：309-314.

〔9〕王晨静，卫建平，张晓琴，等.PCNA、Caspase-3和Bcl-2在不同类型IgA肾病中的表达及意义〔J〕.中国现代医生，2012，50（6）：1-3.

〔10〕YANG B，JOHNSON T S，THOMAS G L，et al.A shift in the Bax/Bcl-2 balance may activate caspase-3 and modulate apoptosis in experimental glomerulonephritis〔J〕.Kidney Int，2002，62（4）：1301-1313.

〔11〕SCHUMACHER V A，SCHI TZER-SCHREHARDT U，KARUMANCHI S A，et al.WT1-dependent sulfatase expression maintains the normal glomerular filtration barrier〔J〕.J Am Soc Nephrol，2011，22（7）：1286-1296.

〔12〕PEIRED A，ANGELOTTI M L，RONCONI E，et al. Proteinuria Impairs Podocyte Regeneration by Sequestering Retinoic Acid〔J/OL〕.J Am Soc Nephrol，2013，24（11）：1756-1768〔2013-9-18〕.http：//jasn.asnjournals.org/ content/early/2013/08/14/ASN.2012090950.

〔13〕GORRIZ J L，MARINEZ-CASTELAO A.Proteinuria：detection and role in native renal disease progression〔J〕. Transplant Rev，2012，26（1）：3-13.

〔14〕DEY B R，SUKHATME V P，ROBERTS A B，et al. Repression of the transforming growth factor-beta 1 gene by the Wilms'tumor suppressor WT1 gene product〔J〕. Mol Endocrinol，1994，8（5）：595-602.

〔15〕RULE A D，AMER H，CORNELL L D，et al.The association between age and nephrosclerosis on renal biopsy among healthy adults〔J〕.Ann Intern Med，2010，152（9）：561-567.

*通信作者：何敏华，教授.

（责任编辑 董 杰）

Expressions and Clinical-pathological Significance of TGF-β1，Caspase-3 and WT1 in Glomerulonephritis

ZHANG Tao，ZHANG Yu，LI Xiaoli，HE Minhua*
（Affiliated Hospital of Dali University，Dali，Yunnan 671000，China）

Objective：To explore the expression and significance of transforming growth factor-β1（TGF-β1），cysteinyl aspartate specific proteinase-3（Caspase-3）and Wilms'tumor suppressor gene 1（WT1）in renal biopsy tissues of glomerulonephritis.Methods：40 cases of renal biopsy tissues and 7 cases of control renal tissues were detected and analyzed by Envision immunohistochemistry.Results：TGF-β1，Caspase-3 and WT1 expressed in all cases of renal tissues.There were significant differences between each trail grouping and normal control group（P<0.05）.The positive retes of TGF-β1in group of mesangial proliferative glomerulonephritis were lower than membranous nephropathy（t=-4.131，P=0.002）.Expression of Caspase-3 showed no differences in divided groups.The expression of WT1 in group of massive proteinuria were lower than that non-massive proteinuria（t=-2.130，P=0.046）.Other designed groups have no significant difference.Meanwhile，higher WT1 expression showed the correlation with lower expression of TGF-β1and Caspase-3.Conclusion：Up-regulated expression of TGF-β1and Caspase-3 and down-regulated expression of WT1 were closely related to pathologic change in kidney.Proteinuria and podcytes loss is probably the predictor of renal disease progression and a cause for glomerulosclerosis.

renal biopsy；TGF-β1；Caspase-3；WT1；proteinuria；immunohistochemistry

R446.8

A

1672-2345（2014）04-0025-05

10.3969/j.issn.1672-2345.2014.04.008

2013-10-11

2014-01-06

张弢，硕士研究生，主要从事肾脏病及风湿免疫病研究.