南瓜烂果病病原菌的分离与鉴定

刘文杰 王文政 罗 兰*

（1 青岛农业大学植物医学学院，山东省植物病虫害综合防控重点实验室，山东青岛 266109；2 潍坊职业学院，山东潍坊 262737）

南瓜为葫芦科南瓜属（Cucurbita）一年生草本植物，在世界范围内广泛栽培，有较高的经济价值和观赏价值（林德佩，2000）。南瓜果实营养丰富，在蔬菜中淀粉含量仅次于豆类及薯芋类作物，并含有较高的VC和蛋白质，其加工品深受糖尿病患者欢迎（胡金宏和张珉，2016）。据FAO统计，2020年全球南瓜产量超过2 000万t，而我国的南瓜产量约占世界总产量的50%（梁伟 等，2021）。南瓜不仅生长期间受到植物病原菌的侵染（曾腊春和李腊生，2010），采后贮藏期间同样也会受到真菌侵染造成烂果，而且损失远远大于生长期，严重影响其经济价值（韦莹莹 等，2012）。2019年露地蔬菜化肥农药双减研究课题组对山东省青岛胶州采集的南瓜进行贮藏期间的病害调查及病原菌分离，并对致病性进行初步研究，以期为南瓜采后病害的防治提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 病原菌的分离

南瓜烂果样品于2019年9月采自山东省青岛市胶州市西安家沟村，南瓜品种为蜜罐。采用组织块分离法，并在病处挑取少量菌丝体，转入PDA平板，28 ℃培养，待长出菌丝后，挑取少量菌丝在PDA培养基上进一步纯化，根据形态学观察和致病性确定为2个菌株，分别命名为Fn和Rn，4℃保存备用。

1.2 病原菌的鉴定

1.2.1 形态学观察 在PDA平板上活化菌株，挑取少量菌丝于光学显微镜下镜检。参考许志刚（2009）的方法观察病原菌形态特征，并对病原菌进行鉴定，初步明确菌株的分类地位。

1.2.2 致病性测定 采用针刺法接种。先将南瓜洗净，75%乙醇表面消毒，晾干后接种培养好的菌株Fn和Rn菌饼，每个瓜接种3处，以不接种为对照，每处理1个瓜，重复3次，用脱脂棉保湿48 h。观察和记录南瓜果实的发病情况。同时，对发病部位组织进行再分离和镜检，比对其形态特征是否与接种的菌株一致。

1.2.3 分子生物学鉴定 利用生工生物工程（上海）股份有限公司DNA快速抽提试剂盒进行Fn和Rn菌株基因组DNA的提取，并以此为模板进行PCR扩增。引物为ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）。采 用25 μL PCR反应体系：ddH2O 17.25 μL、10× EasyTaqBuffer 2.5 μL、dNTPs（2.5 mmol·L-1）2 μL、引物ITS1 1 μL、引 物ITS4 1 μL、DNA 1 μL、EasyTaqDNA Polymerase 0.25 μL。反应程序：94 ℃，3 min；94 ℃ 45 s，58 ℃ 45 s，72 ℃ 40 s，34个循环；72 ℃，10 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳后，由生工生物工程（上海）股份有限公司测序。将获得序列在NCBI中进行BLAST比对，采用MEGA 7.0软件构建系统发育树，确定菌株的分类地位（刘娟，2014）。

2 结果与分析

2.1 南瓜烂果病病原菌的分离

从自然发病的南瓜果实上分离、纯化得到2种病原菌，分别编号为Fn和Rn。Fn在南瓜果实上形成的病斑凹陷，轮纹状，病斑上有白色的菌丝及孢子（图1-a）；Fn在PDA培养基上形成白色菌落，呈放射状生长，气生菌丝较丰富（图1-b）。Rn在南瓜果实上形成的病斑为软腐，按压易破裂，病斑上着生繁茂的灰白色菌丝，菌丝生长速度快，肉眼可见球形或近球形孢子囊（图2-a）；Rn在PDA培养基上生长迅速，初期为白色菌落（图2-b），后期产生黑色孢子囊。

图1 南瓜烂果病的症状与菌株Fn菌落形态

图2 南瓜烂果病的症状与菌株Rn菌落形态

2.2 致病性测定

菌株Fn接种5 d后开始出现病斑，病斑下陷，但不软腐，其上产生菌丝及孢子，随着时间延长病斑进一步扩展（图3），镜检为镰刀菌，发病症状与贮藏期自然发病症状一致。菌株Rn接种后初期出现水渍状腐烂，病斑扩展很快，5 d后产生丰富的菌丝及肉眼可见的孢子囊，接种8 d后整个南瓜果实基本腐烂（图4），镜检为根霉菌，发病症状与贮藏期自然发病症状一致。因此确定菌株Fn和Rn为引起南瓜烂果病的病原菌。

图3 菌株Fn回接后南瓜发病症状

图4 菌株Rn回接后南瓜发病症状

2.3 致病菌的鉴定

2.3.1 形态学鉴定 菌株Fn在PDA培养基上生长缓慢，菌落为白色。经显微镜观察，菌丝有隔，分生孢子梗短、无色（图5-a）；大型分生孢子多细胞，镰刀形；小型分生孢子单细胞，椭圆形至卵圆形（图5-b）。初步鉴定菌株Fn为镰刀菌（Fusariumspp.）。

图5 菌株Fn分生孢子梗和分生孢子的形态

菌株Rn在PDA培养基上生长迅速，菌丝茂盛，初期为白色菌落，后期产生肉眼可见黑色孢子囊。经显微镜观察，菌丝无隔，具假根（图6-a），孢囊梗直立，顶端产生孢子囊，孢囊孢子近球形（图6-b）。初步鉴定菌株Rn为根霉菌（Rhizopusspp.）。

图6 菌株Rn假根、孢囊梗和孢囊孢子的形态

2.3.2 分子生物学鉴定 菌株Fn的rDNAITS序列长度为530 bp（GenBank的登录号为MW467589）。利用Mega 7.0软件构建系统发育树（图7），菌株Fn与腐皮镰刀菌Fusarium solani（GenBank的登录号为LC318412.1）在同一分支上，相似度99.24%。结合形态学特征，确定菌株Fn属于腐皮镰刀菌Fusarium solani。

图7 基于rDNA-ITS序列构建的菌株Fn的系统发育树

菌株Rn的rDNA-ITS序列长度为851 bp（GenBank的登录号为MW467979）。利用Mega 7.0软件构建系统发育树（图8），菌株Rn与匍枝根霉菌Rhizopus stolonifer（GenBank的登录号为KM203865.1）在同一分支上，相似度98.26%。结合形态学特征，确定菌株Rn属于匍枝根霉菌Rhizopus stolonifer。

图8 基于rDNA-ITS序列构建的菌株Rn的系统发育树

3 讨论与结论

本试验从发病南瓜果实上分离获得Fn菌株和Rn菌株，通过对其进行致病性测定和柯赫氏法则验证，明确其为南瓜烂果病的病原菌，可以在机械伤害存在的条件下，通过伤口侵染引起南瓜果实腐烂。经形态学及分子生物学鉴定，Fn菌株和Rn菌株分别为腐皮镰刀菌（Fusarium solani）和匍枝根霉菌（Rhizopus stolonifer）。

镰刀菌种类较多，分为腐生性和寄生性两类，寄生性的镰刀菌是世界范围内分布广泛的一类真菌，寄主范围广，侵染能力强，可侵染植物的根、茎、穗和果实，引起植物的根腐、茎腐等多种病害，如植物生长期间的大白菜枯萎病（闫文雪 等，2018），贮藏期间的马铃薯干腐病和芋艿烂果病（杨波 等，2019；赵璐藐 等，2020）。但有关腐皮镰刀菌（Fusarium solani）引起南瓜贮藏期病害鲜有报道。镰刀菌产生的毒素是危险的食品污染物，对人畜健康造成严重危害。其毒素的种类及特性有待进一步的研究。

根霉菌是实验室常见污染菌，还是条件致病菌，可引起食品霉变，在自然界普遍分布且寄主范围广泛，常造成多种水果如柑橘、桃、蜜瓜、葡萄、枣、草莓等及甘薯的采后腐烂（胡光耀 等，2019；陈江华 等，2020），但引起南瓜果实腐烂未见报道。南瓜在我国种植面积较大，采后病害不容小觑，在采收时应注意不要造成伤口，贮藏期间保持低温干燥，有关引起南瓜果实腐烂的其他病原微生物还有待进一步的调查与鉴定。

本文是由腐皮镰刀菌和匍枝根霉菌引起南瓜烂果病的首次报道。