低温弱光下aga2突变体西瓜果实糖代谢差异表达基因分析

丁双玉 任 毅 宫国义 张海英 郭绍贵 于泳涛 李茂营 张 洁 许 勇*

（1 北京农学院植物科学技术学院，北京 102206；2 北京市农林科学院蔬菜研究中心，农业农村部华北地区园艺作物生物学与种质创制重点实验室，北京蔬菜种质改良实验室，北京 100097）

西瓜（Citrullus lanatus）是我国重要的园艺作物，秋茬栽培西瓜果实膨大期常出现低温胁迫导致果实膨大速度慢，糖度下降，影响西瓜的产量和品质。因此，研究低温影响下西瓜果实糖分积累的响应基因对于提高秋茬西瓜的产量和品质具有重要意义。

低温会引起作物果实的生理生化水平发生变化（Keller &Steffen，1995），其中可溶性糖含量变化是重要的理化指标之一（Shao et al.，2013）。关于低温引起作物果实糖分变化的研究已有较多报道，糖与低温逆境的关联现象最先在马铃薯块茎上被发现（Gounaris，2001），而后在甜瓜（郝敬虹等，2009）、番茄（王丽娟和李天来，2011）、黄瓜（Gu et al.，2017）、甘蔗（Selvarajan et al.，2018）中也检测到果实可溶性糖含量变化与低温关联。低温弱光可降低果实含糖量，郝敬虹（2009）在甜瓜果实膨大期进行夜间9 ℃处理，结果表明低温显著降低了果糖（Fructose）、葡萄糖（Glucose）、蔗糖（Sucrose）、棉籽糖（Raffinose）和水苏糖（Stachyose）含量；王丽娟和李天来（2011）发现，低温下番茄膨大期果实中的果糖、葡萄糖和蔗糖含量均较常温处理下降。

果实糖分积累与温度密切相关，已有研究主要集中于低温下不同种质资源糖代谢酶活性和可溶性糖含量的变化，材料遗传背景差异较大，尚未利用突变体材料挖掘糖分积累关键基因的表达和可溶性糖含量的关系。低温条件下果实糖含量变化的分子机理尚未取得突破，尤其是在西瓜中被低温抑制的关键糖代谢酶基因调控果实糖分积累的分子机制还鲜见报道。研究低温条件下西瓜果实发育阶段糖代谢关键酶基因的作用及调控机制具有重要的理论与实践意义。

碱性α-半乳糖苷酶AGA2（alkaline alphagalactosidase）是将西瓜果实棉籽糖家族寡糖（raffinose family oligosaccharides，RFOs）水解为蔗糖的关键酶（Ren et al.，2021），本试验通过对低温弱光条件下aga2突变体果实进行转录组测序，以期明确aga2果实在低温弱光条件下糖含量下降与糖代谢关键酶基因表达之间的关系，为西瓜果实响应低温弱光环境的糖代谢调控机制的建立以及后续进行的遗传转化奠定基础。

1 材料与方法

aga2是碱性α-半乳糖苷酶（AGA2）基因突变株系，由北京市农林科学院蔬菜研究中心西瓜课题组提供，2019年7月下旬定植于北京市农林科学院蔬菜研究中心试验农场，常规田间生产管理；低温处理（low temperature，简称LT）比正常温度的对照（normal temperature，简称NT）定植时间晚7 d，9月下旬开始授粉，授粉后20 d左右开始感受低温。由于晚7 d定植，低温处理的aga2果实生长期间温度为10～25 ℃，有效积温700 ℃左右，光照强度为100 μmol·m-2·s-1左右；正常温度的对照aga2突变体果实生长期间温度为25～35 ℃，有效积温900 ℃左右，光照强度为300 μmol·m-2·s-1左右。授粉后34 d，果实进入糖分积累的最后阶段，分别取不含种子的中心果肉，3次重复，分别标记为LT34M-1、LT34M-2、LT34M-3、NT34M-1、NT34M-2、NT34M-3，置于-80 ℃冰箱保存。

糖含量测定依据 Hu等（2009）的方法，并加以改进。取样品3 g在研钵中充分研磨后加入 5 mL 80%乙醇，再研磨3 min，置于10 mL离心管中，80 ℃水浴保温30 min，取出冷却至室温，离心后收集上清液，残渣在80 ℃水浴中反复再抽提2次，合并3次抽提液，转入旋转蒸干仪中，在45 ℃低温蒸干，用1 mL超纯水溶解，转入1.5 mL离心管中，12 000 r·min-1离心20 min，0.45 μm水相滤膜过滤，4 ℃保存备用。Shodex Asahipak NH2P-50 4E色谱柱，柱温35 ℃，2410示差折光检测器，流动相比例为70%乙腈∶30%超纯水，流速为1.0 mL ·min-1，糖分标准品均购自sigma公司。果糖、葡萄糖、蔗糖、棉籽糖标准品保留时间分别为：5.544、6.716、8.247、12.200 min。

提取aga2突变体果实总RNA，RNA样品经纯度、浓度和完整性检测等，构建 cDNA分子文库，再对文库的质量进行检测。转录组文库构建、高通量测序和序列组装工作均由北京奥维森基因科技有限公司完成。利用Illumina二代高通量测序平台，采用PE150测序策略得到raw reads pairs，对各样本的原始测序数据进行过滤质控后得到clean reads pairs，分别利用Tophat 2和Cufflinks完成比对和转录本拼接分析，对所有基因进行定量分析，计算各基因的表达水平，定量指标为 TPM（transcripts per million reads）。利 用 DESeq2软 件进行基因差异表达分析，以Padjust ＜0.05和|log2（fold change）|≥1为标准筛选差异表达基因（differential expressed gene，DEG）。将差异表达基因与 GO（gene ontology）和 KEGG（kyoto encyclopedia of genes and genomes）数据库进行比对，对差异表达基因进行功能富集分析，采用Goseq软件进行 GO富集分析，此方法基于Wallenius non-central超几何分布，能更准确地计算出差异基因所富集的GO term的概率。Pathway显著性富集分析以KEGG数据库中Pathway为单位，应用超几何检验，找出差异表达基因显著性富集的Pathway，以Padjust ＜0.05为阈值，满足此条件则认为此GO功能/KEGG通路存在显著富集情况。

对转录组测序中的候选基因进行qRT-PCR验证，并利用 Primer 5.0软件设计扩增引物（表1），采用qPCR的方法对其表达水平进行验证。将各个处理的样品总RNA反转录合成cDNA，以此为模板，进行qPCR反应，以西瓜Actin为内参，采用2–ΔΔCt法计算相对表达量（Livak &Schmittgen，2001），每个目的基因分别进行3次生物学重复和3次技术重复。

表1 qPCR反应所用引物

2 结果与分析

2.1 低温弱光下aga2 突变体西瓜果实表型及糖含量的变化

正常温度和低温弱光下的突变体西瓜果实表型差异明显（图1），低温弱光下授粉34 d后的突变体果实明显不成熟。由图2可知，正常温度下突变体的果实糖含量比低温弱光下高50%左右，其中蔗糖（Suc）含量比低温弱光下高1倍以上；二者蔗糖、果糖（Fru）、葡萄糖（Glc）含量均表现出极显著差异，棉籽糖（Raf）含量差异不显著。

图1 正常温度和低温弱光下aga2 突变体西瓜果实表型差异

图2 正常温度和低温弱光下aga2 突变体西瓜果实糖含量差异

2.2 正常温度和低温弱光下aga2 突变体差异表达基因概况

差异表达基因火山图可以比较直观地反映本组差异基因分布（图3），比较LT34M vs NT34M的差异表达基因，将差异基因的阈值标准设定为：|log2（fold change）|≥1且Padjust ＜0.05，得到突变体西瓜果实中差异表达基因1 676个，其中上调基因686个，下调基因990个，下调基因个数约为上调基因的1.4倍，说明低温弱光下突变体西瓜中更多基因被抑制表达。

图3 差异表达基因火山图

2.3 aga2 突变体西瓜果实中差异表达基因富集的主要代谢途径

GO是一种广泛应用于生物信息领域甚至整个生物领域的分类系统。它主要按照以下3个功能进行分类：细胞组分（cellular component）、分子功能（molecular function）和生物过程（biological process）。差异基因GO富集的柱状图可以直观地反映富集在生物过程、细胞组分和分子功能GO term上差异基因的数量分布。图4显示，LT34M vs NT34M中的下调差异基因主要富集在生物过程中的碳水化合物代谢过程（63个），下调差异基因主要富集在分子功能中的转移酶（126个）、己糖转移酶（27个）、糖基转移酶（29个）、醇基磷酸转移酶（66个）以及激酶（69个）5个亚类。

图4 下调基因GO富集柱状图

KEGG是系统分析基因功能、基因组信息数据库的方法，可将基因及其表达信息作为一个整体网络进行研究。通过KEGG分析LT34M vs NT34M的DEGs，共富集到112个通路，选择富集程度靠前的代谢通路散点图展开分析。下调基因主要富集在激素信号转导（25个）、甾体生物合成（6个）、光合作用（7个）、二萜类生物合成（5个）、DNA复制（6个）、半乳糖代谢（6个）、次级代谢产物的生物合成（61个）以及类黄酮生物合成（3个）等代谢通路上。本试验重点分析了差异基因中负调控的半乳糖代谢途径，筛选此代谢通路上的差异表达关键基因，为后续研究西瓜果实糖代谢关键基因对温度响应表达提供线索。

2.4 aga2 突变体西瓜果实中关键候选基因的筛选及半乳糖代谢途径的分析

通过对差异基因进行GO注释以及KEGG通路分析，并且根据差异基因表达量的变化以及差异表达倍数，筛选出在低温弱光条件下与西瓜果实糖分积累相关的候选基因（表2）。聚类热图可以直观地反映出正常温度和低温弱光下突变体西瓜果实中关键基因的变化情况，如图5所示，经过标准化处理后差异基因类似或相同的表达模式聚类到一起。上调表达的基因主要是MYB、NAC、WRKY家族中的基因，下调表达的基因主要是肌醇半乳糖苷合酶（galactinol synthase，GAS）（Cla009222）和AGA（Cla019238、Cla022883）等半乳糖代谢途径中的关键基因。半乳糖代谢是糖分积累的重要途径，GAS合成棉籽糖合成前体—肌醇半乳糖苷（Galactinol），随后棉籽糖通过AGA水解成蔗糖和半乳糖（Galactose）。

图5 差异基因表达的聚类分析结果

表2 差异表达候选基因信息

通过分析差异基因通路及其表达量发现（图6），低温弱光下突变体中GAS（Cla009222）、AGA（Cla019238、Cla022883）的基因表达均被下调，它们的差异倍数分别是15.0、2.7、3.5倍。

图6 KEGG中半乳糖代谢途径基因表达量分析

2.5 qRT-PCR分析

将图4中的DEGs进行qRT-PCR实时分析，以西瓜Actin基因（Cla97C02G026960）作为内参进行qRT-PCR验证。qRT-PCR中的DEGs的相对表达量与转录组水平相符（图7），各基因在正常温度和低温弱光下的表达量趋势一致，表明转录组水平分析结果可信。

图7 差异表达基因qRT-PCR相对表达量

3 讨论与结论

不同作物中糖代谢关键酶基因响应低温条件下糖分积累的研究显示，低温可诱导果实中酸性转化酶（acid invertase，AI）、中性转化酶（neutral invertase，NI）、蔗糖合成酶（sucrose synthase，SS）、蔗糖磷酸合成酶（sucrose phosphate synthase，SPS）的表达（余芳 等，2014）。在以蔗糖运输为主的作物报道中，低温可导致日本梨蔗糖含量下降和己糖积累，分别与蔗糖磷酸合成酶基因（PpSPS1）转录减少及酸性转化酶基因（PpAIV1）表达增加有关（Itai &Tanahashi，2008）；对番茄进行夜间9 ℃亚低温处理后发现果实中果糖、葡萄糖和蔗糖含量较常温对照均下降，且果实中酸性转化酶和中性转化酶活性与葡萄糖和果糖的含量呈极显著正相关，蔗糖合成酶活性与蔗糖含量呈极显著正相关（王丽娟和李天来，2011）；玉米（Strand et al.，2003）、马铃薯（Wang et al.，2009）、桃（Wang et al.，2013）从转录组水平报道了低温可以抑制蔗糖合成基因的转录表达，从而影响果实糖分积累。对于低温弱光下棉籽糖家族寡糖运输形式的葫芦科作物糖含量变化的报道相对较少。甜瓜果实中水苏糖和肌醇半乳糖苷含量下降主要是由于低温抑制了甜瓜中肌醇半乳糖苷合酶（GAS）活性（郝敬虹，2009）；也有研究发现低温下黄瓜叶肉细胞中的蔗糖、肌醇半乳糖苷、棉籽糖、水苏糖含量上升，其中肌醇半乳糖苷的上升是由于黄瓜肌醇半乳糖苷合酶中的GAS II和GAS III响应低温上调表达所导致（曹文华，2015）；陆慢（2018）证实了4 ℃低温胁迫后黄瓜中可溶性糖含量上升是由于3种水苏糖合成酶基因（stachyose synthase，STS）转录本响应低温从而上调表达。植物体内糖含量在低温下的变化与糖代谢酶关键基因的转录水平密切相关。本试验以aga2突变体西瓜果实作为材料，从转录组水平探索低温下果实糖含量变化，即从响应低温的GAS、AGA基因表达量的变化解释了aga2果实糖含量显著下降的现象。

KEGG通路分析发现上调表达的基因主要是MYB（Cla018501、Cla004362、Cla010413、Cla013099、Cla000899）、NAC（Cla010201、Cla011761）、WRKY（Cla018026、Cla013967、Cla009557、Cla003370）等转录因子，MYB、NAC、WRKY转录因子中抵御低温胁迫的基因在多种作物中被报道，MYB转录因子如西瓜中ClMYB46和Cla007586（高凌云，2016；曹蕾，2017）、苹果中MdMYB88和MdMYB124等（谢银鹏，2018）、玉米中的ZmMYB31（Li et al.，2019）等显著上调表达响应低温逆境。NAC转录因子如花生AhNAC2和AhNAC3基因（刘旭和李玲，2009）、芒 果Mi NACs（余海霞等，2016）、野生黄瓜HdNACs（赵艳青 等，2019）等上调表达抵御低温。WRKY基因家族中分别发现了15个葡萄VvWRKYs（Wang et al.，2014）、10个番茄SlWRKYs（Chen et al.，2015）和12个西瓜ClWRKYs（Yang et al.，2018）均受低温胁迫而显著上调表达。

本试验中半乳糖代谢途径通路中GAS（Cla009222）、AGA（Cla019238、Cla022883）在低温下均显著下调表达。西瓜中糖分积累模式是：UDP-半乳糖（UDP-galactose）和肌醇（Myoinositol）在肌醇半乳糖苷合酶的作用下合成肌醇半乳糖苷并生成UDP，肌醇半乳糖苷和蔗糖在棉籽糖合酶作用下合成棉籽糖和肌醇，韧皮部运输的棉籽糖被α-半乳糖苷酶（AGA）在果实中水解成蔗糖和半乳糖（图6）（Carmi et al.，2003；Ren et al.，2021），蔗糖被果实韧皮部表达的糖转运蛋 白ClVST1（vacuolar sugar transporter）卸载到果肉细胞间隙（Ren et al.，2020），棉籽糖的水解产物α-半乳糖（α-galactose）是UDP-葡萄糖（UDP-glucose）的合成底物，UDP-葡萄糖能与果糖在蔗糖磷酸合成酶作用下合成蔗糖。可见，α-半乳糖苷酶不但直接水解棉籽糖生成蔗糖，还提供了合成蔗糖原料UDP-葡萄糖的合成前体α-半乳糖（崔霞霞 等，2018）。aga2突变体中被敲除的ClAGA2基因在正常温度和低温弱光情况下均不表达，而低温弱光下突变体表现出含糖量降低，说明突变体糖分积累并不完全依赖于此基因的表达，推测可能存在冗余蛋白能够互补ClAGA2的功能且被低温弱光抑制，使得aga2突变体西瓜糖分积累下降。分析差异基因通路及其表达量发现低温弱光下突变体中GAS（Cla009222）、AGA（Cla019238、Cla022883）的基因表达均显著下调，说明Cla009222、Cla019238、Cla022883基因很可能是参与低温弱光介导的控制棉籽糖在西瓜果实中卸载的关键基因。推测低温抑制了该基因的表达从而抑制了α-半乳糖苷酶家族的整体活性，进而影响了棉籽糖水解为蔗糖，从而导致了低温弱光下突变体果实的糖含量下降。这与郝敬虹（2009）在低温下甜瓜中糖代谢酶的研究结果相似。综上所述，推测响应低温弱光的GAS（Cla009222）、AGA（Cla019238、Cla022883）共同下调表达可能是导致突变体西瓜果实光合产物不能充分完成糖代谢最终造成果实糖含量下降的主要原因。

本试验通过转录组数据分析，推测低温条件下西瓜果实糖含量下降的内在因子很可能是棉籽糖合成与卸载的关键酶基因下调表达所致，为西瓜果实响应低温胁迫的糖代谢调控网络研究奠定了基础。