高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱法测定烟草及其制品中3种铅形态

吴若昕，田志章，张春涛，田楠，邢立霞，李登科，马立超

(上海烟草集团有限责任公司 技术中心 天津工作站,天津 300163)

铅是一种在自然界中广泛分布的重金属元素[1],在土壤、环境及生物样品中均有检出,且以不同形态存在,如烟草作物中的铅[2-3]。目前针对铅的分析多限于铅总量的测定,而不同化学形态铅的毒性差异显著,如有机铅的毒性远大于无机铅,不同有机铅毒性也不尽相同[4-6]。中国是烟草生产和使用大国,故对烟草中铅形态进行分析成为维护消费者健康的当务之急[7]。

铅形态分析多采用气相色谱法(GC)、高效液相色谱法(HPLC)、超临界流体色谱法(SFC)等分离技术与原子吸收光谱法(AAS)、原子发射光谱法(AES)、电感耦合等离子体质谱法(ICP-MS)[8-11]等痕量金属检测技术联用的方法。GC 是最常用的分离方法[12],虽然其分离效率较高,但样品前处理复杂(涉及多步净化和衍生化操作),测定结果不稳定。HPLC能够在常温下有效分离性质相近的成分,更适合分离难挥发且热稳定性差的烷基铅[13]。在常见的与HPLC联用的检测器中,ICP-MS凭借其高灵敏度、宽线性范围、可进行多元素/同位素同时测定等优势,成为元素形态分析的首选[14]。二者结合可实现待测元素的亚μg·L－1水平含量测定[15]。在HPLC分析中,常采用含乙二胺四乙酸(EDTA)或其二钠盐的乙酸钠溶液作流动相中的水相。如文献[14]选择以乙二胺四乙酸二钠-乙酸钠溶液和甲醇作为流动相,实现了无机铅[Pb(Ⅱ)]、三甲基铅(TML)和三乙基铅(TEL)的分离,并对水产品中的不同形态铅含量进行了测定。文献[16]以乙酸钠-乙酸缓冲溶液为水相(以EDTA 作为螯合剂),测定大米、猪肉、鳕鱼等食品中铅形态含量。然而采用以上流动相时,不同铅形态分离度较差且色谱峰峰形不对称,难以满足微量和痕量元素的精确定量。ICP-MS在烟草行业的元素分析中的应用常见于单一元素总量的测定[17],鲜少有元素形态分析的报道。本工作通过对样品前处理、色谱条件、质谱条件的系统性优化,建立了HPLC-ICP-MS测定烟草中铅形态含量的方法,旨在为烟草等复杂基质中元素形态分析的方法的开发及元素的形态分布规律研究提供有益参考。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

1260-7700x型高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱联用仪;Milli-Q 型超纯水仪;MARS型微波消解仪;Z300型高速离心机;0.22μm 聚醚砜滤膜。

Pb(Ⅱ)标准储备溶液:10 mg·L－1。

有机铅混合标准储备溶液:1 000 mg·L－1,取适量有机铅标准品三甲基氯化铅、三乙基氯化铅,用2%(体积分数)硝酸溶液溶解并稀释配制成1 000 mg·L－1的有机铅混合标准储备溶液,置于4 ℃避光保存,备用。

不同铅形态标准溶液均由以上2种铅标准储备溶液用流动相逐级稀释制得,现配现用。

冰乙酸、甲醇为色谱纯;1-戊烷磺酸钠为优级纯;30%过氧化氢溶液、硝酸为超纯试剂;三甲基氯化铅和三乙基氯化铅标准品的纯度均为99.99%;试验用水为超纯水。

1.2 仪器工作条件

1.2.1 HPLC条件

ZORBAX Eclipse Plus C18反相色谱柱(100 mm×4.6 mm,3.5μm);柱温30 ℃;进样体积50μL;流量1.0 mL·min－1;流动相为体积比为60∶40的1 mmol·L－11-戊烷磺酸钠溶液和甲醇的混合溶液(pH 4.5);洗脱方式为等度洗脱。

1.2.2 ICP-MS条件

ICP-MS 和 HPLC 的连接管为聚醚醚酮(PEEK)管;射频功率1 550 W;射频电压1.80 V;雾化室温度－5 ℃;冷却气流量15 L·min－1,辅助气流量0.8 L·min－1,载气流量0.9 L·min－1;可选气体[20%(体积分数)氧气,底气为氩气]的体积分数为30%(稀释气为氩气),用于消耗多余的有机相;采样锥为铂锥;炬管为有机进样专用炬管;采样深度8 mm;蠕动泵转速0.3 r·s－1;积分时间(206Pb、207Pb、208Pb)1.0 s。

1.3 试验方法

1.3.1 铅形态的测定

将烟草样品磨碎成末,称取1 g样品于25 mL棕色具塞三角瓶中,加入15 mL流动相,于40 ℃超声萃取20 min。以6 000 r·min－1转速离心10 min,取上清液过0.22μm 滤膜,按照仪器工作条件测定。

1.3.2 铅总量的测定

将烟草样品磨碎成末,称取0.3 g(精确至0.1 mg)样品于消解罐中,依次加入5 mL 硝酸和2 mL 30%过氧化氢溶液,密封,置于微波消解仪中,按表1微波消解程序消解。冷却后,将样品溶液转移至50 mL塑料容量瓶中,用水冲洗消解罐3次,清洗液合并至容量瓶中,用水稀释至刻度,摇匀后按ICP-MS条件测定。

表1 微波消解升温程序Tab.1 Temperature program of microwave digestion

2 结果与讨论

2.1 铅同位素的选择

按照试验方法对加标量为10μg·g－1的烟草样品进行分析,过程中对206Pb、207Pb、208Pb等3 种主要铅同位素进行同时监测。结果显示:3种铅形态中3种同位素质谱响应值之比接近其自然丰度比,说明多原子离子等干扰对测定影响较小。为减少不同来源的实际样品中铅同位素比例差异对测定的影响,试验以3种铅同位素含量之和进行定量。

2.2 色谱条件的选择

2.2.1 色谱柱柱长

基于文献[18],试验采用ZORBAX Eclipse Plus C18反相色谱柱,固定色谱柱内径为4.6 mm,考察了色谱柱柱长分别为50,100,150,200 mm 时对3种铅形态分离效果的影响,结果见图1。

由图1可知:柱长为50 mm 时,Pb(Ⅱ)和TML

图1 色谱柱柱长对3种铅形态分离效果的影响Fig.1 Effect of chromatographic column length on the separation of 3 lead species

不能实现基线分离;柱长为100,150,250 mm 时,3种铅形态均可实现有效分离。综合考虑响应值、分离时间及成本,试验选择ZORBAX Eclipse Plus C18反相色谱柱的柱长为100 mm。

2.2.2 水相1-戊烷磺酸钠溶液浓度

利用反相色谱分离铅化合物时,通常使用有机相和水相的混合溶液配制流动相,其中水相多采用低浓度水平的酸性缓冲溶液、离子对试剂、EDTA的混合溶液[16,19]。但试验发现,采用单一离子对试剂1-戊烷磺酸钠即可实现3种铅形态的分离。故试验进一步考察了水相1-戊烷磺酸钠溶液的浓度分别为0,1,2,4 mmol·L－1时对3种铅形态的分离效果的影响,结果见图2。

图2 1-戊烷磺酸钠溶液浓度对3种铅形态分离效果的影响Fig.2 Effect of concentration of sodium 1-pentane sulfonate solution on the separation of 3 lead species

由图2可知:当流动相中不添加1-戊烷磺酸钠时,Pb(Ⅱ)和TML 保留时间很接近,分离效果差;浓度增至1 mmol·L－1后,Pb(Ⅱ)和TML 的分离度显著增加,3种铅形态均得到较好分离;浓度继续增加,Pb(Ⅱ)峰形逐渐钝化并发生分裂。因此,试验选择1-戊烷磺酸钠溶液的浓度为1 mmol·L－1。

2.2.3 流动相酸度

试验考察了流动相酸度分别为pH 2.5,3.5,4.5,5.5 时对3种铅形态分离效果的影响,结果见图3。

图3 流动相酸度对3种铅形态分离效果的影响Fig.3 Effect of mobile phase acidity on the separation of 3 lead species

由图3可知:当pH 为2.5时,Pb(Ⅱ)、TML的分离效果不佳,且响应值偏低;pH 为3.5～4.5时,Pb(Ⅱ)、TML的响应值增加,分离效果变好;当p H升至5.5时,3种铅形态的保留时间变化不大,但是Pb(Ⅱ)的响应值明显降低。考虑到色谱柱的运行环境酸度不宜过大,试验选择流动相酸度为pH 4.5。

2.2.4 有机相及其体积分数

一般选择甲醇或乙腈作为铅形态分析的色谱流动相中的有机相,试验结果显示,二者产生的峰形并无显著差异,考虑到乙腈较甲醇更易产生积炭[20],试验选择甲醇作为有机相。

试验还考察了甲醇的体积分数分别为10%,20%,30%,40%,50%时对3种铅形态分离效果的影响,结果见图4。

由图4 可知:有机相的体积分数为10%时,30 min内仅有Pb(Ⅱ)流出,分离时间过长;当有机相体积分数增至20%时,3种铅形态分离效果较好,且均在20 min内出峰;有机相体积分数继续增加,Pb(Ⅱ)保留时间基本不变,另2 种有机铅特别是TEL保留时间显著缩短;当有机相体积分数增至50%时,Pb(Ⅱ)和TML 色谱峰重叠。综合考虑分离度和分离时间,试验选择的有机相体积分数为40%。

图4 有机相体积分数对3种铅形态分离效果的影响Fig.4 Effect of volume fraction of organic phase on the separation of 3 lead species

2.2.5 流动相流量

试验考察了流动相流量分别为0.6,0.8,1.0,1.2 mL·min－1时对3种铅形态分离效果的影响,结果见图5。

图5 流动相流量对3种铅形态分离效果的影响Fig.5 Effect of flow rate of mobile phase on the separation of 3 lead species

由图5可知:当流动相流量为0.6 mL·min－1时,3种铅形态能够较好分离,但整体用时较长;流量继续增加,3种铅形态保留时间均有小幅缩短;当流量增加至1.2 mL·min－1时,3种铅形态响应值降低。综合考虑响应值、分离时间和色谱柱的使用稳定性,试验选择的流动相流量为1.0 mL·min－1。

2.3 前处理条件的选择

为避免样品分析过程中溶剂转化造成目标分析物的损失,试验以色谱流动相作为烟草样品萃取液,并考察了不同萃取方法(超声萃取法、微波辅助萃取法)、萃取液体积(5,10,15,20 mL)、萃取温度(20,30,40,50 ℃)以及萃取时间(10,20,30,40 min)等对加标烟草样品(加标量为10μg·g－1)中不同形态铅萃取效率的影响。结果显示:2种萃取方法所得萃取效率无显著差别,但超声萃取法操作更便捷;萃取效率随萃取液体积的增加逐渐上升,但萃取液体积增至15 mL时,继续增加则对提取效果影响不大;在40 ℃下萃取20 min时,萃取效率达到最大,当萃取温度及萃取时间继续增加,萃取效率变化不大。综合考虑萃取效率、检出限和分析用时等因素,试验选择采用15 mL 流动相在40 ℃下超声萃取20 min来处理样品。

按照优化的试验条件分析5 mg·L－1铅形态混合标准溶液和烟草样品,结果见图6。

图6 铅形态色谱图Fig.6 Chromatogram of the lead species

2.4 标准曲线和检出限

按照仪器工作条件测定0.5,1.0,2.0,5.0,10.0,20.0,50.0μg·L－1的3种铅形态混合标准溶液系列,以各铅形态的质量浓度为横坐标,其对应的质谱响应值为纵坐标绘制标准曲线。结果显示:3种铅形态标准曲线的线性范围均为0.5～50.0μg·L－1,其他线性参数见表2。

以3倍信噪比(S/N)计算检出限(3S/N),所得结果见表2。

表2 线性参数和检出限Tab.2 Linearity parameters and detection limits

2.5 精密度和回收试验

按照试验方法对烟草样品进行3个浓度水平的加标回收试验,每个浓度水平平行测定6次,计算回收率和测定值的相对标准偏差(RSD),结果见表3。

由表3可知:3种铅形态的回收率为81.9%～96.5%,RSD 为5.3%～9.6%,表明方法的准确度和重复性均较好,能够满足实际分析需求。

表3 精密度和回收试验结果(n＝6)Tab.3 Results of tests for precision and recovery(n＝6)

2.6 样品分析

选取烟叶样品上、中、下部,分别标记为烟叶1,烟叶2和烟叶3;另取3个卷烟成品的烟丝,分别标记为卷烟Ⅰ、卷烟Ⅱ和卷烟Ⅲ,按照试验方法测定。每个样品平行测定6次,取其平均值作为3种铅形态的测定值,结果见表4。

表4 样品分析结果Tab.4 Analytical results of the samples

由表4可知,烟叶样品及卷烟成品中均未检出有机铅,其铅形态以无机铅为主,且含量均较低(1.53～5.08μg·g－1);烟草样品中铅含量按照部位划分由下到上呈递减分布,下部烟叶中铅含量最高,上部烟叶中铅含量较低;值得注意的是,卷烟成品中的铅含量与烟叶样品的基本处于相同水平,说明烟叶加工过程不会造成铅形态的转化,也未引入其他新的铅形态;检出铅形态含量总和占铅总量的74.3%～84.6%,说明本方法提取出的铅含量较高,可用于烟草中铅形态的分析。

本工作建立了HPLC-ICP-MS 测定烟草中Pb(Ⅱ)、TML 和TEL 含量的方法。通过对前处理、待测元素同位素、色谱柱、流动相离子对试剂、流动相酸度、流动相中有机相体积分数、流动相流量等条件的优化,在8 min内实现了3种铅形态的分离。本工作将铅形态分析引入烟草行业关注范围,可为行业现有的重金属元素分析工作提供有益参考。