LINC01133靶向miR-625调控CCND1促进胰腺癌发展的机制研究

杨富兰

由于胰腺癌的早期症状不明显，因此绝大多数患者在诊断时已处于晚期，胰腺癌的高转移潜力是影响胰腺癌预后不良的重要因素，因此，对胰腺癌转移的分子机制进行分析是开发新治疗方法的基础[1]。微小RNA(microRNA，miRNA)在肿瘤的发生和发展中起重要作用，研究显示miR-625可通过靶向抑制其靶基因的表达在乳腺癌中发挥抑癌作用[2]。长非编码RNA(long non-coding RNA，LncRNA)是一类长度>200个核苷酸、不具有蛋白质翻译功能的长链RNA。LncRNA可以通过靶向miRNA调节信使RNA(message RNA，mRNA)降解和翻译[3]。LINC01133是新发现的一种具有促癌作用的LncRNA，在肺癌中，LINC01133水平升高并且可能与患者不良预后有关，提示LINC01133具有促进肿瘤发展的作用[4]。G1/S-特异性周期蛋白-D1(Cyclin D1，CCND1)是调控细胞增殖的重要蛋白，有研究结果也显示CCND1具有促进肿瘤细胞迁移和侵袭的作用[5]。本文分析LINC01133通过靶向miR-625调控CCND1促进胰腺癌细胞迁移、侵袭的机制。

1 材料与方法

1.1 主要材料与仪器 人胰腺癌细胞系SW1990(ATCC公司，美国)。DMEM培养基(Invitrogen公司，美国)。LINC01133和CCND1过表达质粒和miR-625类似物(mimic)以及相应的阴性对照(negative control，NC)(Thermo Fisher公司，美国)。Lipofectamine 2000(Invitrogen公司，美国)。双荧光素酶报告试剂盒和相应的1000 System荧光检测仪(Promega公司，美国)。细胞计数试剂盒-8(Cell Counting Kit-8，CCK-8)试剂盒(Beyotime生物技术研究所，中国)。Transwell小室(BD Biosciences公司，美国)。PCR引物由Genewiz公司(中国)设计和合成。Trizol试剂(Invitrogen公司，美国)。逆转录cDNA试剂盒和SYBR Green PCR Master Mix qPCR试剂盒(Roche公司，瑞士)。ABI 7500 PCR检测系统(Life technology公司，美国)。RIPA裂解缓冲液(Beyotime公司，中国)。BCA蛋白测定试剂盒和ECL试剂盒(北京Applygen公司，中国)。CCND1、GAPDH抗体和二抗(Abcam公司，美国)。PVDF膜(Bio-Rad公司，美国)。

1.2 生物信息学分析 通过工具网站GEPIA分析TCGA数据库的宫颈癌患者LINC01133水平与宫颈癌进展情况和与CCND1水平之间的关系。然后分析LINC01133与患者预后间的关系。然后预测LINC01133靶向miR-625和miR-625靶向CCND1的结合位点。

1.3 方法

1.3.1 双荧光素酶报告实验：将细胞分为NC组和mimic组，并分别通过质粒转染NC-pMIR-REPORT和miR-625 mimic-pMIR-REPORT。在验证miR-625靶向CCND1时，分别将野生型的CCND1(CCND1-wt)或突变的CCND1(CCND1-mut)克隆到pMIR-REPORT荧光素酶载体中。在验证LINC01133时靶向miR-625时，分别将LINC01133-wt和LINC01133-mut克隆到pMIR-REPORT荧光素酶载体中。将SW1990细胞接种在6孔板中，然后使用Lipofectamine 2000分别将克隆和突变的序列转染至细胞中。使用荧光素酶报告检测仪评估荧光素酶活性。

1.3.2 细胞培养、分组与转染：将SW1990细胞在DMEM培养基中培养，37℃，5% CO2，相对湿度100%。将细胞分为4组，即对照组、LINC01133组、LINC01133+mimic组和mimic组。使用Lipofectamine 2000试剂盒进行瞬时转染，其中mimic组和LINC01133+mimic组组通过转染miR-625 mimic质粒以过表达miR-625，mimic+LINC01133组和LINC01133组转染LINC01133质粒过表达CCND1。对照组转染两种NC质粒，在转染24 h后收集细胞进行后续实验。

1.3.3 qPCR检测LINC01133、miR-625和CCND1 mRNA：通过qPCR检测LINC01133、miR-625和CCND1 mRNA水平。通过Trizol获得细胞中总RNA，然后检测RNA的纯度和浓度。使用cDNA试剂盒将1 μg RNA逆转录合成cDNA(42℃下60 min，70℃下5 min，然后4℃保存)。使用SYBR Green PCR Master Mix进行qPCR实验(在95℃/10 min，40个循环，94℃/15 s，60℃/1 min,60℃/1 min，4℃保存)。GAPDH作为mRNA和LncRNA的内参，U6作为miRNA的内参，通过比较循环阈值(ΔΔCt)用于分析RNA的表达。

1.3.4 Western blot：通过Western blot检测CCND1 蛋白的表达水平。在液氮下将细胞研磨，在液氮保护下使用RIPA裂解缓冲液裂解，并使用BCA蛋白测定试剂盒测量总蛋白含量。然后使用SDS-PAGE分离等量的总蛋白(120 V下电泳90 min)，然后将蛋白转移到PVDF膜上(50 V,120 min)，在含有5%脱脂牛奶的封闭溶液中封闭。然后将PDVF膜与一抗(1∶1 000稀释)在4℃孵育过夜，然后加入1∶5 000稀释的HRP偶联二抗在室温下孵育1 h。使用ECL试剂盒可视化蛋白条带，并使用ImagePD软件使用GAPDH作为内参对蛋白条带的灰度进行定量。

1.3.5 CCK-8检测细胞活力：将2×104个细胞接种在96孔板(每孔100 μl)，在培养第48 h加入10 μl CCK-8试剂并在37℃下培养，通过酶标仪检测450 nm处的吸光度计算相对细胞活力。

1.3.6 细胞划痕实验检测细胞迁移：将4组细胞消化后分别接种在6孔板中，每孔1×106个，然后在37℃，5% CO2，相对湿度100%条件下培养直至90%左右汇合。然后使用200 μl移液枪头从上至下做划痕，将划掉的细胞洗去。然后在相同条件下继续培养24 h。使用倒置显微镜观察并获得图像，测量细胞前缘移动距离的百分比(=两端前缘移动距离/划痕宽度×100%)。

1.3.7 Transwell检测细胞侵袭：在Transwell小室的上室加入基质胶，底室加入完全培养基，然后将3×104个细胞加入至上室培养48 h。48 h后洗去未侵入底室的细胞。然后将细胞使用20%甲醇固定，并用0.2%结晶紫染色。在倒置显微镜下计数每个视野侵入底部室的细胞数目。

2 结果

2.1 生物信息学分析结果 TCGA数据库中，胰腺癌患者的LINC01133水平显著高于正常膀胱组织(P<0.05)。并且高水平的LINC01133与更低的生存率和无进展生存期有关(P<0.05)。见图1。

2.2 LINC01133直接靶向miR-625 通过双荧光霉素实验结果验证同时转染miR-625 mimic和LINC01133-wt的细胞的荧光酶素活性显著降低(P<0.05)。见图2，表1。

表1 LINC01133直接靶向miR-625的双荧光素酶报告结果(相对荧光强度)

2.3 4组细胞中LINC01133和miR-625水平比较 LINC01133组和LINC01133+mimic组LINC01133水平显著高于对照组(P<0.05)，mimic组的miR-625水平显著高于对照组(P<0.05)。LINC01133组miR-625水平显著低于对照组，LINC01133+mimic组的miR-625水平显著高于LICN01133组(P<0.05)。miR-625可逆转LINC01133对miR-625的抑制作用。见表2。

表2 4组细胞中LINC01133和miR-625水平比较

2.4 4组细胞活力比较 与对照组[(100.00±2.45)%]比较，LINC01133组的细胞活力[(127.69±3.78)%]显著升高(P<0.05)，mimic组的细胞活力[(80.32±2.06)%]显著降低(P<0.05)，LINC01133+mimic组的细胞活力显著低于LINC01133组[(102.54±2.55)%](P<0.05)。

2.5 4组细胞迁移能力比较 LINC01133组的细胞迁移和侵袭能力显著高于对照组(P<0.05)，mimic组的细胞迁移和侵袭能力显著低于对照组(P<0.05)，LINC01133+mimic组的细胞迁移和侵袭能力显著低于LINC01133组(P<0.05)。见表3，图3、4。

图3 细胞划痕实验检测4组细胞迁移能力

表3 4组细胞迁移和侵袭能力比较

2.6 miR-625直接靶向抑制CCND1 通过双荧光霉素实验结果验证了同时转染miR-625 mimic和CCND1-wt的细胞的荧光酶素活性显著降低(P<0.05)。并且mimic组的CCND1 mRNA和蛋白的水平显著低于对照组(P<0.05)。见表4，图5、6。

图5 miR-625直接靶向CCND1的结合位点

图6 Western blot检测CCND1蛋白的表达

表4 miR-625直接靶向CCND1的双荧光素酶报告结果(相对荧光强度)

2.7 4组CCND1 mRNA和蛋白水平比较 LINC01133组的CCND1 mRNA和蛋白水平显著高于对照组(P<0.05)，mimic组的CCND1 mRNA和蛋白水平显著低于对照组(P<0.05)，LINC01133+mimic组的CCND1 mRNA和蛋白水平显著低于LINC01133组(P<0.05)。见表5，图7。

图7 Western blot检测CCND1蛋白的表达

表5 4组CCND1 mRNA和蛋白水平比较

3 讨论

2018年的一项全球性的癌症统计结果显示，2017年胰腺癌的新发病例458 918例，占所有肿瘤的2.5%，2017年死于胰腺癌的患者共432 242例，占所有肿瘤的4.5%[6]。胰腺癌为临床上常见的消化道肿瘤，具有恶性高、预后差的特点，胰腺癌患者5年的生存率仅10%左右[7]。内窥镜超声检查/磁共振成像检查和计算机断层扫描是检测胰腺癌的常用手段。胰腺癌的复发和转移是导致预后不佳和患者死亡的主要因素，探究胰腺癌细胞迁移和侵袭的机制具有重要意义。

miRNA在肿瘤中的作用被广泛揭示，miRNA可通过碱基配对的方式直接靶向靶基因的mRNA的3’端的非翻译区域，并引起mRNA的降解和翻译抑制，从而转录后水平上调节基因的表达，调控细胞生物学行为[8]。而miRNA的功能又受到LncRNA的靶向调控，LncRNA可以通过竞争内源性RNA的方式作为“海绵”“吸附”miRNA，从而抑制miRNA的生物学功能，从而调节miRNA在mRNA降解和翻译中的作用[9]。LncRNA通过靶向miRNA调节靶基因表达也是调节肿瘤细胞发生和发展的重要机制之一。LINC01133是一种新发现的与肿瘤相关的LncRNA，Zeng等[10]研究显示LINC01133可作为“海绵”吸附miR-422a并促进骨肉瘤的进展。Zheng等[11]研究显示在肝细胞癌中，LINC01133可通过激活PI3K/AKT通路促进细胞恶性增殖。并且LINC01133会通过靶向miR-4784促进其靶基因AHDC1的表达，从而促进宫颈癌细胞的转移[12]。也有研究显示在结直肠癌和乳腺癌等中，LINC01133具有抑癌作用[13,14]。本研究中，我们首先通过生物信息学分析了LINC01133在胰腺癌中的表达特点，结果显示其显著高于正常膀胱组织，并且高水平的LINC01133与更低的生存率和无进展生存期有关。并且进一步的研究结果也显示过表达LINC01133促进胰腺癌细胞的活力、迁移和侵袭的能力。这说明在胰腺癌中，LINC01133具有促进胰腺癌进展的作用。

此外，本研究还发现LINC01133直接靶向miR-625，并且miR-625直接靶向抑制CCND1 mRNA和蛋白的表达水平。此外，通过细胞实验也证实了过表达LINC01133抑制miR-625的水平并上调CCND1 mRNA和蛋白的表达，并且过表达miR-625会阻断LINC01133对miR-625的抑制作用和对CCND1的促进作用，这提示在胰腺癌细胞中，存在LINC01133/miR-625/CCND1调节途径。并且进一步的细胞学实验结果也显示了miR-625抑制细胞活力、迁移和侵袭，并且阻断了LINC01133对细胞生长、迁移和侵袭的促进作用。Wang等[15]研究显示下调miR-625会通过靶向促进SOX2的表达促进食道癌细胞的增殖和侵袭。Gong等[16]发现miR-625可通过靶向抑制ALDH1A1逆转胃癌细胞的多药耐药性。并且miR-625的作用受到LncRNA的靶向调控[17]。CCND1不但具有调控细胞周期和细胞生长的做用，还具有促进肿瘤转移的作用[18,19]，说明LINC01133促进胰腺癌细胞迁移和侵袭的机制可能通过靶向调节miR-625/CCND1实现。

综上所述，在胰腺癌中，LINC01133具有促癌作用，并且LINC01133可能通过靶向miR-625促进CCND1的表达水平，从而促进胰腺癌细胞生长、迁移和侵袭。