miR-3127-5p靶向TRIM28调控直肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭

甘建雄 李智 赵煜辉 李鹏 李雪莲

直肠癌是最常见的恶性消化道肿瘤之一，其死亡率位居恶性肿瘤第三位，仅次于肝癌和肺癌[1]。由于发病具有隐匿性，当患者出现便血、排便习惯改变等症状时往往处于中晚期或发生转移，侵袭和转移更是导致直肠癌患者死亡的主要原因。因此，寻找新的生物标记物，开发有效的治疗策略对延长直肠癌患者生存时间意义重大。据报道，多种微小RNA(microRNA，miRNA)通过诱导转录后基因沉默以调节细胞增殖、凋亡、迁移或药物敏感性参与直肠癌的发生发展。例如，miR-31[2]、miR-3174[3]在结肠癌肿瘤样本中表达上调，表现为致癌基因，而miR-144等[4]miRNA表达下调，表现为抑癌基因。miR-3127-5p是近年来发现的miRNA，既往研究表明miR-3127-5p在胶质瘤、非小细胞肺癌肿瘤样本中表达降低，过表达miR-3127-5p可抑制肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭[5,6]。然而miR-3127-5p在直肠癌中的确切生物学作用笔者所见尚未有研究。本研究通过检测直肠癌组织样本中miR-3127-5p的表达水平，探究miR-3127-5p在肿瘤发生中的作用，以期为直肠癌临床诊疗提供新的靶点。

1 材料与方法

1.1 细胞株与试剂 人结肠癌细胞株SW1463购于美国模式培养物保藏中心；DMEM培养液、胎牛血清购于美国Hyclone公司；TRIzol试剂、放射免疫沉淀缓冲液购于北京索莱宝公司；逆转录试剂盒、SYBR Green Master Mix购于大连TaKaRa公司；细胞计数试剂盒8(Cell count kit 8，CCK-8)购于日本同仁生化研究所；Transwell小室和基质胶购于美国Corning公司；兔源三结构域蛋白家族28(tripartite motif 28，TRIM28)、p21、细胞周期素D1(CyclinD1)、基质金属蛋白酶2(matrix metalloproteinase 2，MMP-2)、MMP-9和磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde-phosphate dehydrogenase，GAPDH)抗体以及山羊抗兔IgG购于美国Abcam公司；miR-3127-5p模拟物(miR-3127-5p mimics)及其阴性对照(miR-NC)、TRIM28小干扰RNA(si-TRIM28)及其阴性对照(si-NC)、空载质粒(pcDNA)、TRIM28过表达载体(pcDNA-TRIM28)的构建和测序由有南京金斯瑞公司提供。

1.2 细胞培养 将直肠癌细胞SW1463培养在含10%优质胎牛血清的DMEM培养基置于含95%空气、5%CO2、37℃恒温培养箱中进行培养。按照1∶3比例传代，每周2次。

1.3 RT-qPCR检测miR-3127-5p和TRIM28 mRNA表达 采用TRIzol试剂提取直肠癌组织、癌旁组织样本中总RNA，并进行浓度和纯度测定。利用逆转录试剂盒合成cDNAs，利用SYBR Green Master Mix在ABI 7500中上进行实时PCR扩增，采用2-ΔΔCt方法计算目标基因的相对表达水平。TRIM28上游引物5’-AGCGGGTGAAGTACACCAAG-3’，下游引物5’-ACCCAAAGCCATAGCCTTCC-3’；内参GAPDH上游引物5’-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3’，下游引物5’-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3’。

1.4 细胞转染与分组 将SW1463细胞(2×105cells/孔)接种到6孔板，当细胞融合度约为50%时，利用 Lipofectamine 3000将miR-NC、miR-3127-5p mimics、si-NC、si-TRIM28、miR-3127-5p+pcDNA、miR-3127-5p+pcDNA-TRIM28分别转染SW1463细胞，依次记为miR-NC组、miR-3127-5p组、si-NC组、si-TRIM28组、miR-3127-5p+pcDNA组、miR-3127-5p+pcDNA-TRIM28组，转染48 h时检测转染效果，进行后续实验分析。

1.5 CCK-8实验检测细胞增殖活力 细胞按照实验分组践行干预后，胰酶消化后制成密度为3×104cells/ml的单细胞悬液，取100 μl细胞悬液加入到96孔板中，培养24、48和72 h时，每孔加入10 μl的CCK-8试剂，孵育2 h后，采用酶标仪测定各孔450 nm处吸光度值，吸光度值即为细胞增殖活力。

1.6 Transwell实验检测细胞迁移和侵袭能力 将按1∶8 稀释的Matrigel溶液均匀包被于Transwell小室上室膜，室温风干后备用。将Transwell小室置于24孔板中，用无血清DMEM培养基重悬各组SW1463细胞，取200 μl细胞悬液接种于上室腔；取500 μl含20%胎牛血清的DMEM培养基接种于下室腔。常规培养24 h后，用棉签轻轻拭去上室膜细胞，采用4%多聚甲醛固定下室膜15 min，然后用5%的结晶紫溶液固定下室膜15 min。倒置显微镜下随机选取3个视野拍照，记录细胞总数，取均值表示侵袭细胞数。迁移实验时采用未包被基质胶的Transwell小室，其他步骤与侵袭实验相同。

1.7 Western blot检测TRIM28、p21、CyclinD1、MMP-2和MMP-9蛋白表达 用放射免疫沉淀缓冲液消化各组SW1463细胞，获得细胞蛋白。将蛋白样品置于10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶进行电泳；结束后，采用湿法转膜装置将蛋白转移至聚偏氟乙烯膜上。5%脱脂牛奶室温封闭膜1 h；稀释的一抗溶液4℃孵育膜过夜；PBS洗涤后，与稀释的二抗结合2 h。显影后，以GAPDH为内参，用Image J软件分析目的蛋白相对表达水平。

1.8 双荧光素酶报告实验 构建含有miR-3127-5p结合位点序列的野生型(WT-TRIM28)或突变序列的突变型(MUT-TRIM28)荧光素酶报告基因载体由南京金斯瑞生物公司完成。利用Lipofectamine 3000将miR-3127-5p mimics、miR-NC分别与WT或MUT荧光素酶载体共转染SW1463细胞。转染48 h，双荧光素酶报告基因测定系统测定荧光素酶活性。

2 结果

2.1 miR-3127-5p和TRIM28在直肠癌组织中的表达 相较于癌旁组织，直肠癌组织中miR-3127-5p的表达量明显降低，TRIM28 mRNA和TRIM28蛋白的表达量明显升高(P<0.05)。见图1，表1。

图1 TRIM28蛋白表达

表1 miR-3127-5p和TRIM28在直肠癌组织中的表达

2.2 miR-3127-5p过表达对直肠癌SW1463细胞增殖、迁移侵袭的影响 相较于转染miR-NC，转染miR-3127-5p mimics后SW1463细胞miR-3127-5p的表达显著升高，细胞活力、迁移和侵袭细胞数显著降低，CyclinD1、MMP-2和MMP-9蛋白表达显著降低，p21蛋白表达显著升高(P<0.05)。见图2，表2。

图2 增殖、迁移侵袭相关蛋白表达

表2 miR-3127-5p过表达对直肠癌SW1463细胞增殖、迁移侵袭的影响

2.3 miR-3127-5p靶向调控TRIM28的表达 StarBase网站在线预测显示miR-3127-5p与TRIM28的3’UTR之间存在互补的核苷酸序列。双荧光素酶报告实验显示，miR-NC和WT-TRIM28，miR-3127-5p mimics和WT-TRIM28共转染后SW1463细胞荧光素酶活性显著降低(P<0.05)；相较于共转染miR-NC和MUT-TRIM28，miR-3127-5p mimics和MUT-TRIM28共转染后SW1463细胞荧光素酶活性变化差异无统计学意义(P>0.05)。Western blot结果显示，相较于转染miR-NC，转染miR-3127-5p mimics后SW1463细胞TRIM28蛋白表达量显著降低；相较于转染anti-miR-NC，转染anti-miR-3127-5p后SW1463细胞TRIM28蛋白表达量显著升高同，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3、4，图3、4。

表3 双荧光素酶报告实验

表4 miR-3127-5p调控TRIM28蛋白的表达

图3 TRIM28的3’UTR中含有与miR-3127-5p互补的核苷酸序列

图4 TRIM28蛋白表达

2.4 干扰TRIM28表达对直肠癌SW1463细胞增殖、迁移侵袭的影响 相较于转染si-NC，转染si-TRIM28后SW1463细胞TRIM28蛋白表达显著显著降低，细胞活力、迁移和侵袭细胞数显著降低，CyclinD1、MMP-2和MMP-9蛋白表达显著降低，p21蛋白表达显著升高(P<0.05)。见表5，图5。

表5 干扰TRIM28表达对直肠癌SW1463细胞增殖、迁移侵袭的影响

图5 TRIM28和增殖、迁移侵袭相关蛋白表达

2.5 TRIM28过表达逆转了miR-3127-5p过表达对直肠癌SW1463细胞增殖、迁移侵袭的作用 相较于转染miR-NC，转染miR-3127-5p mimics后SW1463细胞TRIM28蛋白的表达量显著降低，细胞活力、迁移和侵袭细胞数显著降低，CyclinD1、MMP-2和MMP-9蛋白表达显著降低，p21蛋白表达显著升高；相较于共转染miR-3127-5p和pcDNA，共转染miR-3127-5p和pcDNA-TRIM28后SW1463细胞TRIM28蛋白的表达量显著升高，细胞活力、迁移和侵袭细胞数显著升高，CyclinD1、MMP-2和MMP-9蛋白表达显著升高，p21蛋白表达显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)。见表6，图6。

图6 TRIM28和增殖、迁移侵袭相关蛋白表达

表6 TRIM28过表达逆转了miR-3127-5p过表达对直肠癌SW1463细胞增殖、迁移侵袭的作用

3 讨论

目前，全球直肠癌病情依然严峻。据统计，全球每年超过100万人诊断为直肠癌，约70多万人死于该疾病，且其年发病率呈升高趋势，已对人类健康和公共卫生构成严重威胁[1]。因此，探索直肠癌发生发展的分子机制有助于对开发新的诊疗策略，对改善直肠癌临床诊疗现状具有重要意义。

近年来，miRNA和恶性肿瘤的相关研究对肿瘤治疗提供了新的思路[7]。Yang等[8]证实非小细胞肺癌中miR-3127-5p呈低表达，且转移性肺癌组织中miR-3127-5p的表达较原发性非小细胞肺癌组织更低，miR-3127-5p低表达可促进非小细胞肺癌细胞的上皮间质转化、迁移和侵袭。miR-3127-5p在肝癌中也呈低表达，过表达miR-3127-5p通过诱导S期阻滞，从而抑制肝癌细胞生长[9]。本研究通过RT-qPCR检测miR-3127-5p在直肠癌组织和癌旁组织样本中表达差异，结果显示直肠癌组织中miR-3127-5p表达较癌旁组织样本显著降低，推测miR-3127-5p在直肠癌中可能发挥抑制基因作用。通过外源性转染miR-3127-5p mimics上调miR-3127-5p表达，直肠癌细胞株SW1463的增殖、迁移和侵袭能力显著降低，促增殖蛋白CyclinD1、促转移蛋白MMP-2和MMP-9表达量显著降低，抗增殖蛋白p21表达量显著升高。进一步证实miR-3127-5p在直肠癌中具有抑癌基因作用。

过表达miR-3127-5p可抑制SW1463细胞株的增殖、迁移和侵袭能力，但其具体作用机制并不明确。本研究通过StarBase数据库分析发现miR-3127-5p与TRIM28的3’UTR之间存在互补碱基序列。TRIM28作为环状结构域蛋白，是DNA损伤反应的关键调控因子，其还可通过抑制p53活性促进肿瘤发生[10]。研究表明，TRIM28在大肠癌[11,12]、胶质瘤[13,14]、非小细胞肺癌[15]、卵巢癌[16]等恶性肿瘤中高表达，干扰其表达可抑制癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力。此外，miR-140-3p通过靶向下调TRIM28表达还可抑制乳腺癌细胞的增殖和迁移[17]。

本研究显示，直肠癌中TRIM28亦呈高表达，提示干扰TRIM28表达可能是抑制直肠癌进展的重要机制。通过双荧光素酶报告基因实验和western blot检测证实TRIM28是miR-3127-5p的下游靶基因，且miR-3127-5p负调控TRIM28表达。通过转染si-TRIM28干扰miR-3127-5p表达，SW1463细胞株的增殖、迁移和侵袭能力显著降低，CyclinD1、MMP-2和MMP-9表达量显著降低，p21表达量显著升高。进一步研究表明过表达TRIM28还可逆转miR-3127-5p对SW1463细胞增殖、迁移侵袭的抑制作用。提示在直肠癌细胞中miR-3127-5p通过靶向下调TRIM28表达参与细胞增殖、迁移和侵袭过程。

综上所述，miR-3127-5p在直肠癌中呈低表达，TRIM28呈高表达。过表达miR-3127-5p通过靶向抑制TRIM28表达可降低直肠癌细胞的增殖、迁移和能力。因此，miR-3127-5p有望成为直肠癌临床诊疗的新靶点。