高糖环境下lncRNA MEG3对人视网膜血管内皮细胞增殖和迁移的作用及其机制△

邵珺 王杨宁致 詹鹏飞

糖尿病视网膜病变(DR)是糖尿病性微血管病变中最严重的并发症之一，已成为当前全球重要的致盲眼病。目前，除了玻璃体内注射抗VEGF药物以及视网膜光凝外，临床上尚缺乏其他有效的控制 DR 发生发展的治疗方法[1-3]。长期高血糖引起的眼部微环境失衡(高糖、缺氧等因素)能够诱发关键基因，如VEGF通路相关基因，在表达水平和表观遗传学上出现异常，这是DR 病情进一步发展的重要原因[4]。因此，观察DR发展过程中关键基因表达水平的变化对深入探索DR的发病机制及其精准治疗均具有重要的意义。长链非编码RNA(lncRNA)是哺乳动物体内常见的非编码RNA，能够通过特异性碱基配对及结合，调控前体mRNA剪接、mRNA翻译以及miRNA的功能，在肿瘤发展以及心血管病变等疾病中均有报道[5]。lncRNA广泛存在于哺乳动物组织器官中，可通过微小RNA(miRNA) 应答元件(MRE)作为miRNA(另一类 22 nt 左右的非编码 RNA)的吸附物而发挥功能[6-8]。lncRNA 在眼部疾病已有报道，如青光眼、视网膜母细胞瘤等[9-10]。有报道表明lncRNA MEG3/mir223/NLRP3炎症小体信号轴可促进内皮细胞凋亡[11]。在DR发病中，lncRNA MEG3可通过 PI3k/Akt信号通路调控视网膜内皮细胞的功能[10]。然而lncRNA MEG3的具体作用机制尚未完全明确。

本研究团队曾利用miRNA 芯片和qRT-PCR进行研究发现，miR-223-3p 在 DR患者的血清和房水中水平均有升高，并通过调控下游FBXW7靶基因抑制DR新生血管生成[12]，通过进一步的生物信息学预测发现，lncRNA MEG3与mir-223-3p可能存在相互作用。因此，本研究旨在探讨lncRNA MEG3在高糖环境下对人视网膜血管内皮细胞(hRECs)增殖和迁移的作用及其机制，为DR的发病机制、临床预防和治疗提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 主要材料hRECs购自中科院上海细胞库，Hek293细胞(人胚肾293细胞；实验室自存)，胎牛血清(FBS)(美国Gibco公司)，DMEM培养基(美国Hyelone公司)，2.5 g·L-1胰蛋白酶、乙二胺四乙酸(EDTA)消化液(凯基生物科技发展有限公司)，二甲基亚砜(DMSO)(美国Amresco公司)，FBXW7抗体(英国Abcam公司)。SuperRT cDNA Kit、2×Taq Master Mix及染料(北京康为世纪生物科技有限公司)，伤口愈合插件(德国Ibidi公司)，ECL化学发光法显色试剂盒(北京索莱宝公司)。siRNA序列由上海吉凯基因化学技术有限公司合成，lncRNA引物由吉玛生物(苏州)股份有限公司设计合成。双荧光素酶报告基因和lncRNA MEG3结合位点或野生型/突变型基因质粒及过表达质粒、miR-223-3p mimics均从上海吉凯基因化学技术有限公司订购。

1.2 方法

1.2.1 hRECs的培养hRECs接种于96孔板，细胞密度为30个·μL-1，置于含体积分数10% FBS、20 g·L-1青-链霉素溶液双抗的DMEM培养基，在37 ℃、含体积分数5%CO2培养箱中培养。将hRECs分为正常(低糖)组、高糖(对照)组、lncRNA MEG3过表达(高糖)组、lncRNA MEG3过表达对照(高糖)组、lncRNA MEG3沉默(高糖)组、lncRNA MEG3沉默对照(高糖)组、lncRNA MEG3过表达+沉默(高糖)组及lncRNA MEG3+miR-223-3p过表达组。正常(低糖)组在培养基中加入5.5 mmol·L-1葡萄糖，所有高糖组在培养基中加入25.0 mmol·L-1葡萄糖。

1.2.2 lncRNA MEG3对hRECs增殖的影响各组hRECs接种于96孔板，细胞密度为30个·μL-1，培养24 h贴壁后，每孔加入10 μL CCK-8试剂，培养箱内培养1 h，于酶标仪450 nm下测各孔光密度(D)。设置足够多的平行培养孔，连续6 d检测各组hRECs增殖情况。

1.2.3 lncRNA MEG3对hRECs愈合能力的影响将上述各组hRECs接种于培养皿，细胞密度为30个· μL-1，培养至融合度达到90%左右后，用移液枪头对细胞表面进行划痕。使用光学显微镜观察并分别在划痕后0 h、24 h 照相，使用IncuCyte ZOOM软件扫描图像并计算各组hRECs划痕相对细胞密度(RWD)。

1.2.4 lncRNA MEG3对hRECs迁移能力的影响各组hRECs置入孔径为8.0 μm的Transwell小室，小室内加入200 μL 含10×103个hRECs的无FBS培养基培养48 h。吸弃上下室培养基，用棉签擦净上室内细胞，24孔板内加入40 g·L-1多聚甲醛室温下固定30 min，吸弃多聚甲醛，PBS冲洗小室背面2遍，24孔板内加入结晶紫600 μL，室温下染色20 min，吸出后PBS冲洗小室背面2遍，光学显微镜下观察上室并照相，任意取5个视野进行hRECs计数。

1.2.5 细胞转染将lncRNA MEG3、抑制剂及miR-223-3p导入hRECs各组hRECs覆盖培养皿底部 70%左右时，吸弃完全培养基，PBS清洗 2～3 次。六孔板每孔 250 μL无血清培养基 Opti-MEM和5 μL lipo2000 配制成混合液，静置 5 min，然后再用适量的质粒和 250 μL Opti-MEM 配制成质粒混合液，静置 20 min，lipo2000 和 Opti-MEM 的混合液加入到质粒混合液中混合均匀。 在六孔板每孔加入 1.5 mL Opti-MEM 然后再加入上面配置好的混合液，放入培养箱中培养 4～6 h。

1.2.6 双荧光素酶报告基因实验观察lncRNA MEG3与miR-223-3p的相互作用RegRNA在线服务器“http://regrna2.mbc.nctu.edu.tw”以及miRcode “http://www.mircode.org/” 在线服务器被用于预测能够与lncRNA MEG3直接相互作用的miRNA，其中，miR-223-3p被预测为lncRNA MEG3的直接靶点。Hek293细胞接种于24 孔板进行培养，待细胞贴壁后将细胞分为lncRNA MEG3野生型对照组、lncRNA MEG3野生型+miR-223 mimic组、lncRNA MEG3突变型对照组、lncRNA MEG3突变型(Site 1)+miR-223 mimic组、lncRNA MEG3突变型(Site 2)+miR-223 mimic组和lncRNA MEG3突变型(Site 1+Site 2)+miR-223 mimic组。使用lipo2000完成上述质粒与miR-223 mimic对Hek293细胞的共转染，步骤同1.2.5。报告质粒构建时，lncRNA MEG3插入萤火虫荧光素酶的3’ UTR区域，而携带海肾荧光素酶基因的质粒则共同转染作为内参。Hek293细胞转染后培养24 h，加入100 μL裂解液裂解细胞15 min。采用双荧光素酶分析系统进行检测，在40 μL 荧光素酶检测试剂 II中加入10 μL细胞裂解液，吹打混匀后，检测萤火虫荧光素酶的活性(D560 nm)，随后加入40 μL荧光淬灭试剂，再次读数，即为海肾荧光素酶的活性(D465 nm)。计算每组的萤光虫荧光素酶/海肾荧光素酶的信号比值，对照组比值为100%。

1.2.7 qRT-PCR检测高糖及低糖环境下hRECs中lncRNA MEG3表达水平采用RNA试剂盒 Takara提取总RNA。利用Taqman miRNA ABC纯化试剂盒提取总RNA，用逆转录酶扩增lncRNA MEG3的cDNA，SYBRgreen实时定量PCR混合物测定lncRNA MEG3在hRECs中的表达，GAPDH作为内参。lncRNA MEG3引物序列：上游引物为5’-AGCGCTTCTGAAGACCAAAC-3’、下游引物为5’-GAACACAAAGACACCCAGCA-3’，大小为20 bp。利用2-ΔΔCt计算hRECs中lncRNA MEG3 mRNA的相对表达水平。

1.2.8 实时荧光定量PCR检测高糖环境下PABPC1过表达或沉默对hRECs中lncRNA MEG3的表达水平的影响pcDNA3.1(+)-PABPC1 过表达质粒以及siPABPC1 沉默RNA由上海吉玛制药技术有限公司合成。在高糖培养基内培养hRECs至培养皿底部细胞覆盖率为60%～70%时，采用Lipo2000试剂盒 (Life Technologies, 美国) 将过表达对照(1 g·L-1)、PABPC1过表达质粒(1 g·L-1)、PABPC1沉默RNA(40 nmol·L-1)以及沉默对照(40 nmol·L-1)转染入hRECs。继续培养48 h后收集细胞，并提取总RNA，采用qRT-PCR方法测定lncRNA MEG3在hRECs内的表达水平(方法同1.2.7)。

1.2.9 Western blot检测lncRNA MEG3对FBXW7蛋白表达水平的影响待各组hRECs覆盖培养皿底部大约70%左右的时候，吸弃培养皿中的完全培养基，用 PBS 清洗 2～3 次。RIPA 裂解液与蛋白酶抑制剂按体积比1001 混合后，每孔加入适量的混合液，放置在冰上 5 min充分裂解。细胞放置在离心管中并在冰上静置 20 min，在 4 ℃下13 000 r·min-1离心 15 min，取上清。上清蛋白经过SDS-PAGE电泳后，将蛋白条带电转至PVDF膜，使用50 g·L-1脱脂奶粉封闭，分别使用兔抗人FBXW7一抗、鼠抗兔二抗完成孵育与洗涤，使用ECL 化学发光法显色试剂盒进行显色。显色后，条带使用Gelpro软件扫描黑度计算相对含量，以各样品对应的GAPDH相对含量为基准。

1.3 统计学方法采用SPSS 19.0统计学软件进行分析。高糖组与正常(低糖)组hRECs中lncRNA MEG3相对表达水平差异比较采用单因素方差分析；不同试剂或质粒转染组间细胞移行数、RWD、细胞中FBXW7蛋白相对表达量、lncRNA-MEG3荧光素酶活性和细胞中lncRNA MEG3相对表达水平差异比较均采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。检验水准：α=0.05。

2 结果

2.1 不同环境下hRECs中lncRNA MEG3的表达水平以正常(低糖)组hRECs中lncRNA MEG3表达量(1.00±0.09)为基准，高糖(对照)组hRECs中lncRNA MEG3的表达量(0.49±0.05)较正常(低糖)组下降，差异有统计学意义(F=73.613，P=0.001)。

2.2 各组hRECs增殖率比较CCK-8法检测结果显示，hRECs连续培养5 d，高糖(对照)组与正常(低糖)组相比，hRECs增殖能力显著上升(F=328.044，P<0.001);lncRNA MEG3过表达(高糖)组 hRECs增殖能力显著低于lncRNA MEG3过表达对照(高糖)组(F=121.193，P<0.001)；lncRNA MEG3 沉默(高糖)组hRECs增殖能力稍高于lncRNA MEG3沉默对照(高糖)组，但差异不显著(F= 0.689，P=0.453)(见表1)。

2.3 过表达或沉默lncRNA MEG3对hRECs愈合及迁移能力的影响细胞划痕实验结果发现，高糖(对照)组hRECs[RWD(98.2±9.6)%]愈合速度显著高于正常(低糖)组[RWD(30.5±4.5)%](F=85.735，P=0.005);lncRNA MEG3过表达(高糖)组hRECs[RWD(33.6±4.3)%]愈合速度显著低于lncRNA MEG3过表达对照(高糖)组[RWD(30.5±4.5)%](F=121.193，P<0.001)；而lncRNA MEG3沉默(高糖)组hRECs[RWD(99.7±9.2)%]愈合速度略高于lncRNA MEG3沉默对照(高糖)组[RWD(93.6±8.8)%]，但两者差异不显著(F=0.689,P=0.453)(图1A)。

图1 过表达或沉默lncRNA MEG3对各组hRECs愈合能力及迁移能力的影响 A：愈合实验观察过表达或沉默lncRNA MEG3对hRECs愈合能力的影响；B：Transwell实验观察过表达或沉默lncRNA MEG3对hRECs迁移能力的影响。图中标尺为200 μm。

Transwell实验结果发现，高糖(对照)组hRECs[细胞迁移数(377±22)个]迁移速度显著高于正常(低糖)组[细胞迁移数(322±24)个](F=89.240，P=0.008)；lncRNA MEG3过表达(高糖)组hRECs[细胞迁移数(209±18)个]迁移能力显著低于lncRNA MEG3过表达对照(高糖)组[细胞迁移数(319±36)个](F=22.407，P=0.009)；而lncRNA MEG3沉默(高糖)组hRECs[细胞迁移数(497±51)个]迁移能力显著高于lncRNA MEG3沉默对照(高糖)组[细胞迁移数(352±33)个](F=17.093，P=0.014)(图1B)。

2.4 双荧光素酶报告基因实验验证lncRNA MEG3与miR-223-3p的直接作用经预测，lncRNA MEG3具有与miR-223-3p直接配对的两个潜在靶点(见图2)。lncRNA MEG3与miR-223-3p的潜在直接作用位点位于MEG3序列的301-324位(位点1)以及498-518位(位点2)。

图2 lncRNA MEG3与miR-223-3p的作用位点

双荧光素酶报告基因实验检测发现，添加miR-223-3p后野生型 lncRNA MEG3的荧光素酶活性由(100.0±8.3)%降至(51.5±6.2)%(F=66.691,P=0.001)，突变型 lncRNA MEG3的荧光素酶活性由(98.8±6.8)%降至(61.5±5.1)%(位点1，F=58.657,P=0.002)和(70.3±6.2)%(位点2，F=29.104，P=0.006)。而在lncRNA MEG3的双位点(位点1+位点2)突变中，荧光素酶活性由(98.8±6.8)%降至(97.8±8.3)%，差异不显著(F=0.049，P=0.836)。该结果验证了lncRNA MEG3的位点1和位点2都能够和miR-223-3p发生直接的相互作用。

2.5 miR-223-3p mimic 逆转过表达lncRNA MEG3对hRECs增殖的抑制作用当同时转染过表达lncRNA MEG3质粒和miR-223-3p后，可恢复高糖的细胞表型(见表2)。lncRNA MEG3过表达可显著抑制hRECs增殖，而共转染miR-223-3p mimic后，lncRNA MEG3过表达对hRECs增殖的抑制作用被逆转了。

表2 CCK-8法测定miR-223-3p对过表达lncRNA MEG3后hRECs增殖的影响

2.6 miR-223-3p mimic 逆转了过表达lncRNA MEG3对hRECs细胞愈合以及迁移能力的抑制作用愈合实验结果发现，高糖(对照)组hRECs愈合能力[RWD(85.5±7.3)%]与lncRNA MEG3过表达对照(高糖)组[RWD(86.3±8.2)%]差异无统计学意义(F=0.145，P=1.553)；lncRNA MEG3过表达(高糖)组hRECs愈合能力[RWD(28.9±3.6)%]显著低于lncRNA MEG3过表达对照(高糖)组(RWD(86.3±8.2)%](F=89.732，P=0.002)和lncRNA MEG3 +miR-223-3p过表达(高糖)组[RWD(87.6±9.0)%](F=110.016，P<0.001)及lncRNA MEG3过表达+沉默(高糖)组[RWD(89.5±7.5)%](F= 97.332，P=0.001)(图3A)。

图3 共转染miR-223-3p对lncRNA MEG3过表达后hRECs愈伤以及迁移的影响 A：共转染miR-223-3p对lncRNA MEG3过表达后hRECs愈合能力的影响；B：共转染miR-223-3p对lncRNA MEG3过表达后hRECs迁移能力的影响。图中标尺为200 μm。

Transwell实验结果显示，高糖(对照)组hRECs迁移数[(385±41)个]与lncRNA MEG3过表达对照(高糖)组[细胞迁移数(352±37)个]差异无统计学意义(F=0.357，P=0.972)；lncRNA MEG3过表达(高糖)组hRECs迁移数[(187±22)个]显著低于lncRNA MEG3过表达对照(高糖)组[细胞迁移数(352±37)个](F=35.725，P=0.003)； lncRNA MEG3过表达(高糖)组hRECs迁移数显著低于lncRNA MEG3 +miR-223-3p过表达(高糖)组[细胞迁移数(322±34)个](F=33.338，P=0.004)；而lncRNA MEG3过表达(高糖)组hRECs迁移数显著低于lncRNA MEG3过表达+沉默(高糖)组[细胞迁移数(309±28)个](F= 30.457，P=0.007)(图3B)。结果表明，lncRNA-MEG3可通过调控 miR-223-3p进一步影响hRECs的愈合和迁移能力。

2.7 lncRNA过表达对miR-223-3p下游靶点FBXW7的影响Western blot检测结果显示，正常(低糖)组hRECs中FBXW7蛋白相对表达量显著高于高糖(对照)组(F=195.226，P<0.001); lncRNA MEG3过表达(高糖)组hRECs中FBXW7蛋白相对表达量显著高于lncRNA MEG3过表达对照(高糖)组(F=185.443,P<0.001)，而lncRNA MEG3+miR-223-3p过表达(高糖)组或lncRNA MEG3过表达+沉默(高糖)组中，这一趋势得以逆转(F=162.257，P<0.001；F=145.293，P<0.001)(图4)。这表明lncRNA MEG3为miR-223-3p的上游基因，可调控mir-223-3p的下游靶点并发挥作用；lncRNA MEG3、miR-223-3p以及FBXW7处于同一信号通路内。

图4 Western blot检测各组hRECs内FBXW7蛋白表达 1：正常(低糖)组；2：高糖(对照)组；3：lncRNA MEG3过表达对照(高糖)组；4：lncRNA MEG3过表达(高糖)组；5：lncRNA MEG3+miR-223-3P过表达(高糖)组；6：lncRNA MEG3过表达+沉默(高糖)组。

2.8 PABPC1对hRECs中lncRNA MEG3相对表达水平的影响高糖条件下，hRECs中lncRNA MEG3的表达水平(1.00±0.05)为基准；相对于lncRNA MEG3过表达对照组(0.98±0.04)，PABPC1基因的过表达则显著提升了hRECs中lncRNA MEG3的相对表达水平(1.64±0.13)(F=70.638，P=0.001)；相对于lncRNA MEG3沉默对照(1.02±0.07)，PABPC1基因的沉默则显著降低了hRECs中lncRNA MEG3的相对表达水平(0.49±0.03)(F=145.293，P<0.001)。这说明PABPC1可能是lncRNA MEG3的上游调控元件。

3 讨论

DR作为高致盲眼病之一，临床上尚无有效的根治方法。因此，全面了解 DR的潜在发病机制可为临床医师有效防治DR提供新的理论依据[13]。课题组曾研究发现,DR发病中，miR-223-3p的表达上调是导致细胞增殖的重要因素[12]。近年来，lncRNA被确定为新的转录和表观遗传网络的调节因子[14-15]，lncRNA可以像分子“海绵”一样吸附下游miRNA而调节生物学功能[8-9]。即lncRNA可以竞争性地结合miRNA发挥作用。现有研究表明，lncRNA与一些眼部疾病及血管生成相关[10, 16]。在DR进展过程中，lncRNA-RNCR2、NEAT2、CDKN2B-AS1和PVT1均有显著变化[9]; lncRNA MALAT1通过调节 miR-125b/ve-cadherin 信号轴促进DR新生血管的生成。

本研究中，我们利用RegRNA以及miRcode等在线生物信息学预测工具预测了lncRNA MEG3和miR-223-3p存在两个潜在的结合位点，并进一步采用双荧光素酶基因报告实验进行验证，结果显示，miR-223-3p能够抑制带有野生型lncRNA MEG3序列质粒的荧光素酶活性，这说明两者是有直接结合的；而突变位点1后，荧光素酶活性显著下降，但下降幅度低于野生型，突变位点2后，荧光素酶活性下降幅度继续降低。这说明，预测的两个位点在lncRNA MEG3与miR-223-3p的结合中起重要作用，而突变位点2发挥了主要的作用。在高糖培养环境中，hREC中lncRNA MEG3表达显著低于正常低糖环境，这说明lncRNA MEG3在DR的相关生理环境中可能是受到抑制的。根据前期报道，在人主动脉内皮细胞内miR-223-3p 水平与lncRNA MEG3有一定的关系[11]，而在本研究中，在高糖环境中lncRNA MEG3 过表达可以抑制hRECs的增殖能力、愈合能力以及迁移能力，但这种影响趋势能够被共转染的miR-223-3p或沉默lncRNA MEG3逆转，这说明miR-223-3p极有可能是lncRNA MEG3的直接下游靶点。此外，在前期研究中，miR-223-3p 的3’ UTR 区域被证明可以与FBXW7直接相互作用，并进一步影响 notch1通路[12,17]。因此，本研究观察了高糖环境中lncRNA MEG3过表达对FBXW7的影响，结果显示：过表达lncRNA MEG3能够显著提升hRECs中FBXW7蛋白表达水平，而共转染miR-223-3p或lncRNA MEG3后，该趋势被逆转。这进一步证实了高糖环境下lncRNA MEG3、miR-223-3p与FBXW7处于同一信号通路内。

根据前期报道，PABPC1是一种核酸结合蛋白，通过结合 RNA分子的 poly (a)尾部，参与调节途径和稳定lncRNA[18-20]。为了探索lncRNA MEG3的上游作用元件并解析高糖环境中lncRNA MEG3水平降低的分子机制，本研究利用调控PABPC1的水平来干预lncRNA MEG3,结果显示，高糖环境中，过表达PABPC1可以显著提升lncRNA MEG3在hRECs中的相对表达水平；而沉默PABPC1基因后，lncRNA MEG3相对表达水平也显著降低。这说明PABPC1极有可能是lncRNA MEG3的上游调控元件。

综上，本研究围绕hRECs展开体外细胞水平的工作，在模拟DR的高糖环境下，lncRNA MEG3被证实为miR-223-3p分子的直接上游调控元件，并通过miR-223-3p对hRECs的增殖、愈合以及迁移能力等进行抑制，同时也初步验证了lncRNA MEG3的上游调控元件可能为PABPC1。