杞菊地黄胶囊防治激光性视网膜损伤的作用机制：基于网络药理学探讨

张目 于文洲

糖尿病视网膜病变(DR)是糖尿病的常见并发症，是中老年人视力下降的主要原因之一[1]。视网膜激光光凝术是DR的重要治疗手段，能有效封闭和预防新生血管形成, 促进出血吸收。但是，激光在治疗的同时也是一种创伤性技术,会破坏正常视网膜结构及视网膜屏障，引起脉络膜缺血、炎症以及新生血管形成等医源性损伤[2]。目前，临床上缺乏有效防治激光性视网膜损伤的西医措施，随着中医药现代化的不断发展及临床应用的不断深入，中医药防治激光性视网膜损伤的临床疗效已逐渐被大家所认可，因此寻求安全有效的中药方剂用于防治激光性视网膜损伤具有重要的临床意义。中医认为激光性视网膜损伤的病机属于“热毒郁结，肝肾阴虚”。基于上述认识，我们选择具有滋肾养肝、清肝明目功效的杞菊地黄胶囊作为防治激光性视网膜损伤的代表方应用于临床，并取得显著疗效。但是，杞菊地黄胶囊防治激光性视网膜损伤的具体作用机制尚未可知。

网络药理学是一种新兴技术，它将系统生物学和计算生物学相结合，用来研究多组分和多目标制剂[3]。本研究运用网络药理学知识预测杞菊地黄胶囊防治激光性视网膜损伤的潜在机制，为今后激光性视网膜损伤的治疗及相关机制研究提供参考。

1 资料与方法

1.1 杞菊地黄胶囊活性成分与靶点筛选基于中药系统药理学数据库(http://tcmspw.com/tcmsp.php)[4]，获取杞菊地黄胶囊的活性成分及其潜在靶点，通过口服生物利用度≥30%和类药性≥0.18[5]，筛选出有效成分，并根据既往文献补充药物的有效成分，然后依据Uniprot数据库(https://www.uniprot.org)标准确定对应基因名称。

1.2 激光性视网膜损伤相关治病靶点的筛选在Therapeutic Target Database数据库(http://db.idrblab.net/ttd/)、Drugbank3.0数据库、DisGeNET 5.0数据库(https://www.disgenet.org)以“laser induced retinal injury”为关键词检索激光性视网膜损伤的潜在靶点，并将潜在靶点导入 Uniport数据库(http://www.uniprot.org/)进行基因标准化，删除重复及无法标准化靶点基因后整合汇总，作为疾病的潜在靶点基因。

1.3 药效靶点及其蛋白相互作用核心网络的构建运用韦恩图选取药物靶点与疾病靶点的交集作为药效靶点，再将这些药效靶点导入String数据库(https://string-db.org/)进行分析，在结果页面下载TSV格式文件，将文件输入到Cytoscape3.7.2软件，在新的页面选择“degree”，其余默认选择，最终点击Apply建立蛋白质相互作用核心网络图。网络中的节点代表蛋白，节点之间连接线的粗细与蛋白质之间的相关作用强度呈正相关。

1.4 靶点基因的功能富集分析Metascape平台(http://metascape.org)整合了京都基因与基因组百科全书(KEGG)、基因本体(GO)、Uniprot等多个权威数据库，可对靶点进行GO与KEGG富集分析，因为其数据每月更新一次，保证了数据的准确性[6-7]。将关键靶点导入Metascape平台进行GO及KEGG分析，物种选择人类(homo sapiens,human)，利用微生信工具(http://www.bioinformatics.com.cn/)绘制相关条形图和气泡图进行结果可视化。本研究的设计流程图见图1。

图1 杞菊地黄胶囊对激光性视网膜损伤治疗作用的分析设计流程图

2 结果

2.1 杞菊地黄胶囊活性成分与靶点在中药系统药理学技术平台数据库中，通过口服生物利用度和类药性参数筛选后，获得139个活性成分，其中枸杞45个，菊花20 个，熟地2个，茯苓15个，山茱萸20个，山药16个，泽泻10个，牡丹皮11个,将活性成分对应的靶点导入 Uniprot 在线数据库进行基因标准化，完善基因信息，删除无注释及重复靶点后，得到238个成分靶点，口服生物利用度排序前9位成分靶点见表1。

表1 杞菊地黄胶囊口服生物利用度排序前9位成分靶点

2.2 激光性视网膜损伤相关靶点在TTD、Drugbank3.0、DisGeNET 5.0数据库检索激光性视网膜损伤相关靶点，汇总所有数据库后去除重复值，获得相关疾病靶点911个，如：肿瘤坏死因子(TNF)、白细胞介素(IL)-6、TP53、IL-10等。

2.3 药效靶点及PPI核心网络图构建将药物活性成分与疾病共同的135个靶点导入String数据库进行分析，将String数据库分析的结果通过Cytoscape3.7.2软件进一步分析和可视化，并建立相应的网络，结果见图2。图2显示20个节点[TNF、IL-6、血管内皮生长因子A(VEGFA)、AKT1、TP53等]，64条边，每个节点代表一个相关的蛋白，药效作用更强的蛋白质用较大的结点和较深的颜色描述。

图2 杞菊地黄胶囊治疗激光性视网膜损伤的PPI核心网络图

2.4 功能富集分析将交集靶点导入Metascape平台进行GO及KEGG分析，并通过MetaboAnalyst3.0对结果进行可视化。GO富集分析结果显示，杞菊地黄胶囊治疗激光性视网膜损伤的靶点主要涉及癌症的通路、糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、IL-17信号通路、人T细胞白血病病毒1型感染、HIF-1信号通路、铂类耐药性、利什曼病、NF-κB信号通路等(见图3)。

图3 杞菊地黄胶囊治疗激光性视网膜损伤的GO富集分析

KEGG功能注释富集分析结果显示，135个作用靶点共富集到307条信号通路，选前20条信号通路进行富集分析,圆形节点越大，富集基因数量越多，颜色越红则富集越显著。相关靶点主要富集于糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、IL-17信号通路、NF-κB信号通路、HIF-1信号通路等(见图4)。

图4 杞菊地黄胶囊治疗激光性视网膜损伤的KEGG富集分析

3 讨论

激光光凝术在治疗DR的同时，其光热效应也会对视网膜造成损伤。目前，西医对此没有针对性的治疗和预防措施。中医学将视网膜称之为“视衣”，内应于肾，肾主水，故视网膜属“五轮学说”之水轮；肝开窍于目，肝受血而能视，因此目中阴液源于肝肾。中医认为激光性热毒所引起的改变属火热蕴结，灼伤肝肾中阴液，使目窍失养，视网膜由清澈透明转为白色。DR多为老年患者，天癸竭，肾脏衰，故素体肝肾亏虚者居多，加之激光火毒之邪，最终导致“热毒郁结，肝肾阴虚”病机的形成。

结合DR激光光凝术后的病因病机特点，我们选择以滋补肝肾、清肝明目为治法。本法指用具有滋养肝肾阴液、清热解毒明目的方药治疗眼科疾病。瞳神属水轮，由肾所主，而“视衣”为瞳神的一部分，亦属肾，肝肾精血相生，肝血为养目之源，肾精为司明之本，故从肝肾论治。因此，本研究选用具有滋补肝肾、清肝明目功效的杞菊地黄胶囊进行治疗。

杞菊地黄胶囊由杞菊地黄丸去蜂蜜而成，杞菊地黄丸出自《医级宝鉴》，以六味地黄丸为基础方加枸杞、菊花组成，具有滋补肾阴、清肝明目的功效。方中主药熟地黄补血滋肾阴、填精，枸杞子滋补肝肾精血；辅以山药益脾肾之阴而固精，山茱萸酸温益肝肾精血；佐以茯苓淡渗脾湿，牡丹皮清肝泻火、活血化瘀，泽泻泄肾中湿浊，菊花清肝明目。诸药合用，滋补与清泄兼顾，扶正与祛邪同治，共奏滋养肝肾、清肝明目之功效，临床多用于治疗肝肾阴虚所致的眩晕耳鸣，羞明畏光，迎风流泪，视物昏花。研究发现，杞菊地黄丸可以“保护青光眼患者的视网膜”、“改善气阴两虚型DR患者的眼底病变”、“改善孔源性视网膜脱离复位术后患者术眼视网膜功能”，因此其广泛应用于治疗青光眼、DR、视网膜脱离[8-10]。

虽然目前对杞菊地黄胶囊的药理研究不多，但是杞菊地黄胶囊的基础方六味地黄丸具有增强机体抗氧化防御功能，降低糖尿病患者的胰岛素抵抗指数及增高胰岛素敏感指数[11]，促进眼部细胞新生、降低眼部毛细血管通透性的药理特性。枸杞、熟地黄、山药具有抗氧化的作用, 能够加速对自由基的清除[12-13],对缺血、光毒作用、炎症等引起的视网膜的结构和功能的损害具有保护作用。山茱萸、牡丹皮、茯苓能够抑制炎症介质相关蛋白基因的表达和炎症因子的释放,增加抗炎因子水平,发挥抗炎作用[14-16]。

激光所引起的视网膜损伤涉及免疫反应、炎症反应、氧化损伤等多个方面。本研究运用网络药理学技术，预测了杞菊地黄胶囊治疗激光性视网膜损伤的作用机制，药物活性成分与靶点分析结果显示，酸浆苦素A、薯蓣皂苷配基等主要活性成分在激光性视网膜损伤治疗中起着重要作用。现代药理学研究指出，酸浆苦素A可以减轻相关炎症反应[17]，薯蓣皂苷配基具有抗炎症、抗氧化活性的药理作用[18-19]。

根据PPI网络图分析发现，TNF、VEGFA、IL-6等可能是杞菊地黄胶囊治疗激光性视网膜损伤过程中的关键靶点。激光性视网膜损伤最主要的表现是炎症细胞浸润和新生血管形成。研究发现，激光诱导的脉络膜新生血管中TNF、VEGF、IL过度表达[20-21]。其中TNF-α作为视网膜内皮细胞通透性增加的有效介质，可以刺激视网膜色素上皮细胞,导致VEGF表达升高，促进新生血管形成。此外，本研究分析也发现，AKT1、TP53等基因与激光性视网膜损伤相关性也较密切，其作用有待更进一步的研究加以明确。

GO富集分析结果提示，杞菊地黄胶囊可能通过抑制炎症反应、免疫反应、氧化应激反应等生物学过程发挥治疗激光性视网膜损伤的作用。结合KEGG分析结果，杞菊地黄胶囊可能对AGE-RAGE信号通路、NF-κB信号通路、HIF-1信号通路等多条信号通路具有调节作用。研究表明，AGE-RAGE信号可激活NF-κB信号通路，NF-κB可促进促炎症细胞因子(如IL-6和TNF)以及与激光性视网膜损伤相关的基因VEGFA 的表达，从而加剧炎症反应[22]。HIF-1 信号通路在应对机体缺氧过程中发挥着重要的作用，HIF-1α是HIF-1的一个亚单位，缺氧、血糖浓度升高等因素均可诱发其表达增多，HIF-1α可激活下游多种靶基因，共同发挥改善视网膜缺氧的作用[23]。杞菊地黄胶囊还可调节其他多条通路，在IL-17信号通路、癌症的通路、胰岛素抵抗等通路中均发挥着重要作用，符合中药多成分、多靶点、多通路综合治疗疾病的特征。

综上所述，杞菊地黄胶囊以滋补肾阴、清肝明目的功效在治疗激光性视网膜损伤中发挥着重要的作用，杞菊地黄胶囊中的酸浆苦素A、薯蓣皂苷配基等有效成分，可能通过作用于TNF、IL-6、VEGFA 等靶点，调节AGE-RAGE信号通路、NF-κB信号通路以及HIF-1信号通路，抑制视网膜内皮细胞的氧化应激反应、炎症反应、免疫反应，从而治疗激光性视网膜损伤。