脂褐素成分A2E诱导人视网膜色素上皮细胞自噬及损伤的研究△

张晶晶 陈云珍 黄旅珍 陈莉

年龄相关性黄斑变性(AMD)是一种临床上常见的黄斑变性类疾病，可造成进行性、不可逆性中心视力丧失，是全球发达国家成年人致盲的首要疾病之一[1-3]。随着我国人口老龄化进程的日益加剧，由AMD所致的盲目人群数量激增，给整个社会带来巨大的精神及经济负担。AMD的病理改变主要是视网膜色素上皮(RPE)细胞和光感受器细胞的丢失和损伤，最终造成视力损害。脂褐素又称“老年色素”，在眼部主要存在于RPE细胞内，是细胞在衰老过程中逐渐积累的一种棕黄色物质[4]。脂褐素含有十余种不同的成分，包括各种蛋白质、脂质及代谢残骸等，近年来人们逐渐认识到N-亚视黄基-N-视黄基-乙醇胺(A2E)是脂褐素中重要的基团[5]。脂褐素及其主要成分A2E作为不完全降解的残余物长期堆积在RPE细胞内，会造成细胞的衰老及凋亡，是黄斑变性发生、发展的主要因素之一[6]。

自噬是细胞对于环境变化的有效反应，对新陈代谢具有举足轻重的作用。一方面，自噬可以作为一种防御机制应对因饥饿、缺氧、氧化应激等对细胞造成的损伤，清除有缺陷的蛋白或者细胞器；另一方面，如果自噬被过度激活，它也可以启动“自噬性细胞死亡(autophagic cell death)”程序或者和凋亡协同作用导致细胞的死亡[7]。因此，自噬是一把双刃剑。现有的研究已发现自噬与AMD病理机制相关，可能参与了RPE细胞氧化应激后的清除过程[8]，但对于自噬在RPE细胞损伤和AMD发病机制中的确切作用尚不十分清楚。因此，本研究旨在探讨自噬对人RPE细胞内脂褐素成分A2E诱导的细胞损伤和炎症反应中的作用，并为治疗AMD提供了一种可能的策略。

1 材料与方法

1.1 材料人RPE细胞系ARPE-19购于美国ATCC公司。A2E由北京大学人民医院眼科实验室黄旅珍研究员馈赠。DMEM-F12培养液(Sigma-Aldrich，美国)；胎牛血清(Gibco，美国)；CCK-8细胞活性检测试剂盒(Dojindo，日本)；ProcartaPlex细胞因子检测试剂盒(Panomics，美国)；兔抗人LC3抗体、兔抗人Beclin-1抗体、兔抗人p62抗体(Abcam，美国)；兔抗人β-actin抗体、山羊抗兔二抗(Cell Signaling Technology，美国)；小鼠抗兔荧光二抗(Invitrogen，美国)；Luminex 200仪器、电泳仪、聚丙烯酰胺垂直电泳及转膜系统(BioRad，美国)；超微切片机(Wetzlar，德国)；荧光显微镜(Nikon，日本)；透射电子显微镜(FEI，美国)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及处理ARPE-19细胞采用含体积分数10%胎牛血清的DMEM-F12完全培养液，置于37 ℃、含体积分数5%CO2的细胞培养箱中培养。每隔2 d更换一次细胞培养液，当细胞培养至 80%～90%融合时，用2.5 g·L-1胰蛋白酶消化传代进行后续实验。

1.2.2 A2E作用浓度筛选ARPE-19细胞按每孔5000个接种于96孔板中，每组设5个复孔。分别用含A2E浓度为0 μmol·L-1、10 μmol·L-1、20 μmol·L-1、30 μmol·L-1的DMEM-F12完全培养液培养细胞，每种浓度分别设1 h、3 h、6 h、12 h、24 h 5个时间点终止培养，之后用PBS清洗两次后更换为100 μL含100 g·L-1CCK-8的DMEM-F12完全培养液继续孵育2 h，酶标仪检测450 nm波长的光密度，实验独立重复3次。筛选出A2E的适宜作用浓度进行后续实验研究。

1.2.3 细胞因子检测用含20 μmol·L-1A2E的DMEM-F12完全培养液培养ARPE-19细胞6 h 和12 h后终止培养，吸取细胞培养上清液进行细胞因子检测，同时用不含A2E的DMEM-F12完全培养液培养的ARPE-19细胞作为对照。根据ProcartaPlex细胞因子检测试剂盒说明书的操作步骤，选择与AMD发病密切相关的10种细胞因子和趋化因子进行检测，被检测的因子包括：细胞间黏附分子(ICAM)、白细胞介素(IL)-1β、IL-6、IL-8、IL-10、促血管生成素-2(Ang-2)、胎盘生长因子(PIGF)、胰岛素样生长因子1(IGF-1)、转化生长因子-β(TGF-β)以及血管内皮生长因子A(VEGFA)。在滤板的每孔中加入50 μL抗体珠，用洗涤液冲洗；每孔加50 μL细胞培养上清液，室温孵育1 h，加入25 μL检测抗体溶液，室温下500 r·min-1振动滤板30 min；加入链霉亲和素-PE，用Luminex 200仪器进行检测。实验独立重复3次。

1.2.4 透射电子显微镜观察细胞超微结构取对数生长期的ARPE-19细胞，加入含有20 μmol·L-1A2E的DMEM-F12完全培养液进行培养，分别于 1 h、3 h、6 h、12 h、24 h后倒掉含A2E的培养液，将各组细胞用预冷的PBS洗2遍，用细胞刷刮下细胞，收集后2000 r·min-1离心10 min，弃上清，留细胞沉淀，同时用不含A2E的DMEM-F12完全培养液培养的ARPE-19细胞作为对照；将4 ℃预冷的体积分数2.5%戊二醛固定液沿管壁缓慢加入沉淀的细胞中，4 ℃固定2 h后转移到4 ℃ PBS中保存1～2 h，PBS漂洗3次；将样品加入4 ℃预冷的锇酸固定液中，4 ℃ 固定2 h，PBS漂洗3次，梯度酒精脱水；环氧树脂浸透包埋样品，超薄切片机切片；醋酸铀和柠檬酸铅双染色，透射电子显微镜下观察细胞结构并拍片。

1.2.5 免疫荧光染色检测细胞中LC3的表达取对数生长期的ARPE-19细胞，以每孔40 000个接种于24孔板，孔板内置入载玻片，常规培养24 h后更换培养液；用含有20 μmol·L-1A2E的DMEM-F12完全培养液分别培养6 h、12 h、24 h，同时用不含A2E的DMEM-F12培养液培养的ARPE-19细胞作为对照。取出细胞爬片，用40 g·L-1多聚甲醛PBS固定15 min；体积分数0.1% Triton X-100穿透液渗透10 min；血清封闭液封闭30 min；滴加兔抗人LC3抗体(1100)4 ℃过夜；PBS洗3次，滴加小鼠抗兔荧光标记二抗(1200)，37 ℃避光反应2 h，PBS洗3次后荧光淬灭封片剂封片；暗室中荧光显微镜下选择波长为490 nm观察LC3绿色荧光斑点并计数。

1.2.6 Western blot检测Beclin-1和p62的表达取对数生长期的ARPE-19细胞常规培养至70%～80%融合时，用含有20 μmol·L-1A2E的DMEM-F12完全培养液分别培养1 h、3 h、6 h、12 h、24 h，同时用不含A2E的DMEM-F12完全培养液培养的ARPE-19细胞作为对照。将收获的ARPE-19细胞溶解在RIPA缓冲液，12 000 r·min-1、4 ℃离心30 min去除细胞碎片，收集上清液，采用BCA法对蛋白样品进行定量；SDS-PAGE电泳转移到PVDF膜；用50 g·L-1脱脂牛奶封闭膜 1 h，配制适当浓度的一抗(Beclin-1抗体，11000；p62抗体，11000；β-actin抗体，11000)，将PVDF膜放入其中，并以50 r·min-1的速度摇晃1 h后4 ℃ 过夜；TBST洗涤缓冲液摇床上洗涤3次；15000稀释的辣根过氧化物酶标记的二抗室温下孵育1 h。利用ImageJ软件分析结果，实验独立重复3次。

1.3 统计学方法采用GraphPad Prism 6进行统计学分析，计量资料用均数±标准差表示。多组间的比较采用完全随机设计的单因素方差分析，两组间的比较采用t检验。检验水准：α=0.05。

2 结果

2.1 不同浓度A2E对ARPE-19细胞增殖的影响CCK-8法检测ARPE-19细胞在不同时间点的增殖结果显示，与对照相比，10 μmol·L-1的A2E分别作用ARPE-19细胞1 h、3 h、6 h、12 h、24 h后细胞增殖无明显变化；20 μmol·L-1的A2E作用于ARPE-19细胞6 h细胞活性开始下降，细胞增殖受到抑制，随作用时间延长，细胞活性下降更明显，与对照相比差异均有统计学意义(均为P< 0.05)；当A2E浓度达到30 μmol·L-1时，与对照相比，A2E作用3 h细胞增殖即受到明显抑制(P<0.001)，提示该浓度对细胞具有较高的毒性作用(图1)。因此本实验选择20 μmol·L-1的A2E进行后续研究。

图1不同浓度A2E对ARPE-19细胞增殖能力的影响 与对照相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

2.2 A2E对ARPE-19细胞分泌细胞因子的影响采用多重细胞因子检测技术检测20 μmol·L-1的A2E作用于ARPE-19细胞后各种细胞因子的表达变化结果显示，ARPE-19细胞6 h起，细胞因子ICAM、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、Ang-2、IGF-1、TGF-β表达水平均有所升高，与未给予A2E处理的对照相比，差异均有统计学意义(均为P<0.05)，细胞因子PIGF和VEGFA的表达水平在20 μmol·L-1A2E作用12 h后也明显升高(均为P<0.01)(见图2)。提示A2E能够刺激ARPE-19细胞分泌多种AMD相关的炎症因子、趋化因子和血管生长因子。

图2 20 μmol·L-1A2E作用于ARPE-19细胞6 h、12 h后对各细胞因子的影响 与对照相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

2.3 A2E对ARPE-19细胞超微结构的影响利用透射电子显微镜观察A2E能否诱导ARPE-19自噬的发生，结果显示，最早从20 μmol·L-1的A2E作用1 h开始，ARPE-19细胞的细胞质内可以见到由双层膜构成的碗状结构即“吞噬泡”，尚未收口，这是自噬体开始形成的标志；在随后的3 h、6 h，观察到了典型的双层膜自噬体结构；A2E作用12 h和 24 h 时，可以看到溶酶体膜和自噬泡膜融合后形成的单层膜结构的自噬溶酶体结构；自噬溶酶体在A2E作用24 h时开始出现内容物减少，体积逐渐缩小，提示自噬溶酶体的退化和降解(图3)。至此，通过电子显微镜证实了A2E能够激活ARPE-19细胞的自噬反应，并观察到整个自噬潮发生的动态过程。

图3 透射电子显微镜下观察20 μmol·L-1A2E作用于ARPE-19细胞不同时间对细胞形态的影响 A：对照；B：作用1 h；C：作用3 h；D：作用6 h；E：作用12 h；F：作用24 h。

2.4 免疫荧光染色检测A2E对ARPE-19细胞LC3表达的影响用浓度为20 μmol·L-1的A2E作用于ARPE-19细胞，通过荧光显微镜观察LC3蛋白形成的绿色荧光斑点，结果显示，与对照相比，20 μmol·L-1的A2E作用于ARPE-19细胞6 h起即可见细胞质内LC3荧光呈现点状聚集，此时斑点数量较少，体积较小，弥散在细胞质中，至12 h时荧光斑点数量达到最多，颗粒也最大，差异最明显，24 h时绿色荧光斑点数量开始下降，荧光强度也较前减弱(图4)，提示自噬溶酶体开始退化和降解，自噬活性逐渐减弱。

图4 20 μmol·L-1A2E作用于ARPE-19细胞不同时间后LC3荧光颗粒的表达

2.5 Western blot检测自噬相关蛋白的表达用浓度为20 μmol·L-1的A2E作用于ARPE-19细胞，Western blot检测自噬相关蛋白Beclin-1和p62的表达，用以评价自噬的水平。结果显示，与未给予A2E处理的对照相比，给予20 μmol·L-1A2E处理后1 h、3 h、6 h、12 h及24 h的ARPE-19细胞中Beclin-1蛋白的表达水平均显著升高(均为P<0.01)，其中作用12 h时的蛋白表达量达到最高，这与上述LC3荧光斑点的表达变化相一致；与对照相比，20 μmol·L-1A2E处理后不同时间点ARPE-19细胞中p62蛋白的表达水平均显著下降(均为P<0.05)(图5)。

图5 20 μmol·L-1A2E作用于ARPE-19细胞不同时间后自噬相关蛋白的表达 与对照相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

3 讨论

AMD是目前影响老年人视力和生存质量的主要眼科疾病之一，其发病机制尚不十分明确，仍缺乏有效的治疗手段。近年来的研究表明，一种年龄相关的色素——脂褐素及其核心成分A2E在AMD的发生和发展中起着重要作用，它们随年龄增长而沉积于视网膜下，并可能通过慢性光化学作用损伤局部视网膜和脉络膜，从而导致AMD的发生[9]。

脂褐素是一种脂质或蛋白质的聚合物，存在于不同组织有丝分裂后细胞的溶酶体内。A2E作为脂褐素主要的载体成分，是视黄醛代谢后在RPE细胞内沉积的产物，由于它难于降解，就以脂褐素的形式积聚在RPE细胞中[10]。一些学者对RPE细胞中各种溶酶体酶活性在A2E影响下的变化进行检测；另一些学者在体外细胞实验中发现，脂褐质大量聚集降低了RPE细胞的吞噬功能[11-13]。由于A2E对离体培养的ARPE细胞的损伤作用有时间和剂量累积效应，因此寻求合适的时间和剂量是进一步研究A2E在AMD发病中作用的关键。有研究报道，人眼内RPE细胞中A2E的浓度水平为每105个细胞中 60～130 ng[14]或每眼中含830 pmol[15]，这相当于体外用浓度为15～30 μmol·L-1的A2E培养ARPE细胞数小时的水平[16]。本研究中当A2E浓度为20 μmol·L-1时，一方面对体外培养的ARPE-19细胞产生一定的损伤作用，另一方面与人眼中的A2E浓度最接近，能更好地模拟人眼内RPE细胞的生理和病理情况，是理想的实验观察浓度。因此，我们选择20 μmol·L-1的A2E进行后续实验。

近年来，有学者陆续发现A2E与AMD发病中的某些重要环节具有相关性。正常情况下，RPE细胞会产生大量免疫抑制因子(如IL-18、IL-37等)，防止过度免疫炎症反应损伤眼内组织[17]。当RPE细胞受损时，不能分泌足够的抑制因子，眼内免疫豁免稳态丧失，眼内长期处于慢性炎症状态，长期积累损伤导致了AMD的发生[18]。RPE细胞激活后将分泌大量促炎因子，诱发炎症免疫反应的瀑布式激活。Anderson等[19]发现，A2E能够刺激RPE细胞产生炎症相关趋化因子和细胞因子，而包括NLRP3、Caspase-1和ASC在内的炎症小体参与了这一过程。Caspases作为炎症小体的“反应器”，可以将无活性的炎症因子的前体[主要为IL-1β前体(pro-IL-1β)和IL-18前体(pro-IL-18)]水解为有活性的成熟因子(如IL-1β、IL-18)，进而产生炎症反应[20]。而 NLRP3炎症小体激活，能够使其信号通路下游炎症因子IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、IL-33以及 TNF-α等分泌增加[21]。RPE功能受损不仅会导致脉络膜毛细血管代谢障碍、光感受器细胞死亡，而且诱发的局部炎症反应可以促进新生血管生成[22]。Iriyama等[23]发现，在小鼠视网膜下注入A2E三周后能够诱导RPE细胞死亡，并伴有RPE和脉络膜内VEGF表达水平的升高。本研究采用20 μmol·L-1的A2E作用于ARPE-19细胞，选择了10种与AMD发病密切相关的炎症因子、趋化因子和血管生长相关因子(包括ICAM、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、Ang-2、PIGF、IGF-1、TGF-β及VEGFA)，检测ARPE-19细胞培养上清液中各种细胞因子的变化，结果证实，A2E能够刺激RPE细胞分泌多种炎症相关细胞因子和血管生长相关因子，这为A2E与AMD发病机制中炎症、新生血管之间的联系提供了进一步的证据。

自噬是一种细胞内成分自我降解的过程，包括自噬的诱导、自噬体膜的形成、自噬体的形成、自噬体与溶酶体的融合以及内容物的降解[24]。自噬对细胞有着双重作用，一方面它可以清除受损病变的细胞器及大分子物质，或为饥饿条件下的细胞提供能量和底物；但持续而剧烈的自噬却会导致自噬性细胞死亡，又称为II型程序性细胞死亡[25]。本研究中，我们将A2E作用于ARPE-19细胞，结果显示，ARPE-19细胞质内开始出现碗状、尚未收口的双层膜结构的“吞噬泡”，随着时间推移出现自噬体结构以及自噬溶酶体结构，这些统称为自噬囊泡。自噬囊泡在A2E作用24 h时开始出现内容物减少，体积逐渐缩小，提示自噬溶酶体的退化和降解。至此，我们通过透射电子显微镜证实了A2E作用于RPE细胞能够激活细胞的自噬反应，并观察到整个自噬潮发生的动态过程。

自噬过程由自噬相关基因(Atg)调控，LC3(Atg8)是自噬体膜上的标记蛋白，LC3蛋白在合成后其C端即被Atg4蛋白酶切割变成LC3-I，LC3-I散在分布于细胞质内。当自噬体形成后，LC3-II始终稳定地保留在自噬体膜上直到与溶酶体融合，因此被用来作为自噬体的标记，且LC3-II的水平在某种程度上反映了自噬体的数量[26-27]。自噬发生过程中，通过免疫荧光的方法检测内源性LC3荧光强度的变化即可以反映自噬活性，自噬诱导后的细胞表现为荧光斑点状聚集增多。BECN1是酵母中自噬基因Atg6的同源物，是第一个被发现的自噬相关基因[28]。其编码的Beclin-1蛋白可调控自噬前体的形成，引导其他的Atg蛋白在自噬体膜上的定位[29]。研究发现，过表达Beclin-1可以加强血清和氨基酸撤除诱导的自噬，说明Beclin-1是自噬重要的正调节因子[30]。Beclin-1-/-小鼠自噬缺陷，细胞凋亡却正常，说明Beclin-1是自噬特异性的调控基因[31]。因此，通过Western blot检测Beclin-1的表达水平，能够对细胞的自噬活性进行进一步的判断。p62是一种自噬连接蛋白，Komatsu等[32]报道了p62和LC3之间的关联，证实p62在自噬中的作用。研究表明，p62介导了自噬转换的蛋白质聚集物的形成，这表明p62通过自噬促进了蛋白质的选择性降解。因此，p62作为一个适配器，结合泛素化的蛋白质聚集物，并将它们传递给自噬体[33]。本研究中，20 μmol·L-1A2E作用下的ARPE-19细胞中Beclin-1蛋白的表达明显增加，p62蛋白的表达明显下降，说明A2E能够引起ARPE-19细胞自噬活性的增加，Beclin-1及p62蛋白可能参与了这一过程。

综上所述，本研究证实了20 μmol·L-1的A2E能够诱导ARPE-19细胞的自噬发生；该浓度的A2E同时能够抑制ARPE-19细胞的增殖，并刺激多种AMD相关炎症因子和新生血管因子的分泌。至于本研究中A2E引起的自噬激活在这一过程中究竟扮演了何种角色，还有待于后续进一步研究。