血清miR-146a-3p水平与PCI术后冠心病动脉支架内再狭窄的相关性研究

杨志刚，罗进光

冠状动脉粥样硬化性心脏病（冠心病）是威胁人类健康的常见心血管疾病，患者发病率及病死率都很高，且发病呈年轻化趋势，危害健康[1]。经皮冠状动脉介入术（PCI）在临床上应用广泛，但患者易发生支架内再狭窄（ISR），给家庭和

社会带来沉重负担[2,3]。因此，寻找早期预测ISR的因子对于及早预防PCI后冠心病动脉ISR具有重要意义。微小RNA（miRNA）在多种疾病中应用广泛，可能与炎症、氧化应激、癌症等关系密切，其中miR-146a-3p在冠心病中高表达，且与疾病严重程度呈正相关，可能对其有较高预测价值[4,5]；在PCI不稳定型心绞痛患者发生ISR中miR-146a-3p水平升高，可作为预测PCI患者发生ISR的生物学标志物[6]，因此miR-146a-3p对于预测ISR具有较高价值。本研究检测PCI冠心病患者血清中miR-146a-3p水平，探究其与ISR间的关系，为临床上PCI冠心病患者早期预测ISR提供一定参考。

1 资料与方法

1.1 研究对象选自2017年6月至2019年6月于河南省安阳市第六人民医院接受院内PCI的197例冠心病患者为研究对象，其中男性133例，女性64例，年龄45～82（63.2±7.8）岁，所有患者随访3～18个月，均行冠状动脉（冠脉）造影，冠脉造影显示ISR（狭窄直径≥50%）患者76例（ISR组），无ISR患者121例（无ISR组）。本研究经本院伦理协会审核通过。诊断标准：符合全国冠心病座谈会上关于冠心病诊断标准[7]。纳入标准：符合冠心病诊断标准且首次接受PCI患者；患者均成功植入雷帕霉素药物涂层支架1枚；术后患者均接受阿司匹林、氯吡格雷抗凝治疗；所有患者均在发病12 h内PCI；患者资料完整。排除标准：出现严重心、肾功能不全患者；合并重大疾病，如：恶性肿瘤、急性感染等患者；存在自身免疫缺陷疾病患者。收集患者一般资料，包括：年龄、性别、体质指数（BMI）、高血压史、卒中史、吸烟史、饮酒史；所有患者术后2 h取静脉血5 ml，检测空腹血糖（FBG）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、高敏C反应蛋白（hs-CRP）。

1.2 实时荧光定量PCR（qRT-PCR）法检测血清中miR-146a-3p水平静脉血置于促凝管中，3000 r/min离心10 min，收集血清。血清miRNA提取试剂盒（美国Invitrogen公司，货号：货号：AM1561）提取miRNA，分光光度计（美国Thermofisher公司，型号：NanoDrop ND 1000）检测RNA纯度和浓度，miRNA First Strand cDNA Synthesis Kit（赛默飞世尔，货号：K1622）合成cDNA，荧光定量PCR仪（瑞典Roche公司，型号：LightCycler480）检测血清中miR-146a-3p水平。miR-146a-3p上游引物：5’-GTCGTAT CCAGTGCAGGGTCCG-3’，下游引物5’-GC GGCCTCTGAAATTCAGTT-3’；U6上游引物：5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’、下游引物：5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’（上海生工生物工程股份有限公司合成）。反应体系20 μl：1 μl 50 ng/μl cDNA、上/下游引物（10 μmol/L）各0.5 μl、10 μl 2×SYBR Premix Ex Taq（日本TAKARA公司，货号：RR420A）、8 μl ddH2O。反应条件：95℃预变性30 s；95℃变性30 s，60℃退火45 s，共40个循环。2-ΔΔCt法计算miR-146a-3p相对表达水平。

1.3 统计学分析利用SPSS 25.0进行统计学分析，计数资料采用例数（构成比）表示，组间比较采用χ2检验；计量资料符合正态分布，用（均数±标准差）（±s）表示，行t检验；Logistic分析影响PCI后冠心病动脉ISR的因素；受试者工作特性（ROC）曲线分析血清中miR-146a-3p水平对PCI后冠心病动脉ISR的诊断价值。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组患者一般资料比较两组患者性别、高血压史、卒中史、吸烟史、饮酒史、年龄、BMI、HDL-C水平差异无统计学意义（P＞0.05）。与无ISR组相比，ISR组血清中FBG、LDL-C、hs-CRP水平升高（P＜0.05），表1。

表1 两组患者一般资料比较

2.2 两组患者血清中miR-146a-3p水平情况与无ISR组相比，ISR组血清中miR-146a-3p水平升高（P＜0.05），表2。

表2 两组患者血清中miR-146a-3p水平比较

2.3 Logistic分析影响PCI后冠心病动脉ISR的因素将PCI术后冠心病患者是否发生ISR为因变量，FBG、LDL-C、hs-CRP、miR-146a-3p为自变量行Logistic多因素分析，结果显示miR-146a-3p（OR=1.439，95%CI：1.156～1.792）是PCI后冠心病患者发生ISR的独立危险因素（P＜0.05），表3。

表3 影响PCI术后冠心病患者发生ISR的多因素分析

2.4 血清中miR-146a-3p水平诊断PCI后冠心病患者ISR的效能分析ROC曲线显示，血清中miR-146a-3p预测PCI后冠心病患者发生ISR的曲线下面积为0.836（95%CI：0.777～0.895），截断值为1.256，此时的敏感度为77.60%、特异度为81.80%（图1）。

图1 血清中miR-146a-3p预测PCI术后冠心病患者发生ISR的ROC曲线

3 讨论

冠心病是冠脉粥样硬化引起的血管狭窄或堵塞现象，造成心脏供血不足，缺氧缺血，出现一系列心脏重构疾病[8,9]，是患者致死、致残的主要原因，PCI能够改善冠心病患者的临床和预后状况，在治疗中具有明显效果[10]。但PCI会使血管内皮损伤，导致内皮基质暴露在血液中，内皮细胞损伤、造成大量炎症因子聚集、细胞因子及趋化因子聚集、血小板聚集等导致平滑肌细胞迁移和过度增殖，引起血管组织重构和肉芽增生等，导致ISR，影响治疗效果[11,12]。本研究以197例行PCI的冠心病患者为研究对象，其中冠脉造影显示ISR（狭窄直径≥50%）患者76例（38.58%）；无ISR121例（61.42%），在PCI术后冠心病患者ISR易造成血管阻塞，严重时危害生命安全，因此，早期发现ISR并及早治疗对于疾病意义重大。

miRNA是一类19-25个核苷酸组成的内源性非编码小分子RNA，可以通过抑制或促进靶基因mRNA降解发挥作用[13]，且每种miRNA可以调控多种靶基因的表达。已有研究发现miR-330-5p在PCI后冠心病ISR患者血清中水平低于非ISR患者，且与血管生成因子受体关系密切，可以作为预测ISR的预测指标[14]，发现更多与ISR相关miRNA对于疾病治疗意义重大。miR-146家族由miR-146a、miR-146b组成，其中miR-146a定位在5号染色体上，具有免疫调控功能[15]。研究发现miR-146a与血管的生物性能关系密切，可以明显提高内皮细胞增殖、迁移、侵袭能力，降低内皮细胞的凋亡率，对于血管生成有促进作用[16]。另外促炎因子浓度、NF-KB转录活性等均可调节miR-146a的表达水平，且miR-146a可以直接作用于炎症因子受体负调控炎症和免疫[17]。miR-146a-5p和miR-146a-3p是来源于同一个茎环miRNA的两个不同成熟体miR-146a，其中miR-146a-3p在脂多糖诱导的滋养层细胞中高表达，且可以激活TLR4诱导分泌IL-8[18]；miR-146a-3p与细胞的迁移、侵袭、转移关系密切[19,20]，可能影响内皮细胞生长。在本研究中，发现miR-146a-3p在PCI后冠心病发生ISR患者中高表达，其可能促进炎症因子分泌、促进内皮细胞增殖、侵袭、迁移，从而造成ISR，加重疾病。另外本研究发现，ISR患者与无ISR患者血清中FBG、LDL-C、hs-CRP水平存在差异，但在本研究中可能受病例例数限制这些因素没有成为影响ISR发生的因素。进一步Logistic分析发现，miR-146a-3p是PCI后冠心病患者发生ISR的独立危险因素，提示miR-146a-3p水平升高可能影响下游靶向基因mRNA的表达，从而发挥作用。ROC曲线显示，血清中miR-146a-3p预测PCI后冠心病患者发生ISR的曲线下面积为0.836，截断值为1.256，此时的敏感度为77.60%、特异度为81.80%，提示当miR-146a-3p水平＞1.256时，PCI后冠心病患者发生ISR的几率增加，临床上应该受到重视。

综上所述，PCI后冠心病动脉ISR患者血清中miR-146a-3p水平升高，是ISR发生的独立危险因素，且可以预测ISR，在临床上应该受到重视。本文首次验证了miR-146a-3p与PCI后冠心病动脉ISR的关系，具有一定意义。但miR-146a-3p下游靶基因众多，具体作用机制尚不清楚，另外支架类型、植入情况等亦影响疾病状况，临床上需综合考虑。