白藜芦醇对人胃癌耐药细胞SGC⁃7901/5⁃FU生物学效应的影响及其作用机制

储文梅 熊旭东 何淼 计高荣 陈莉云 童佳 张卓成 李黎

胃癌是发病率与死亡率均较高的消化道恶性肿瘤，据2020年全球癌症统计报告，胃癌在2020年的全球癌症新发病例中排名第五，致死率全球排名第四［1］。手术切除是胃癌的主要治疗方式，并以5⁃氟尿嘧啶（5⁃fluorouracil，5⁃FU）为主的化疗方案为辅［2］。然而部分患者不可避免地出现耐药，致使药物疗效降低甚至无效，且化疗药物耐药胃癌患者目前尚没有有效的治疗方法。白藜芦醇（resveratrol，RES）是一种来源于虎杖、葡萄与花生等植物的多酚化合物，具有抗炎、抗氧化、抗衰老、抗血栓与抗肿瘤作用，且生物安全性高，毒副作用小，价格低廉，来源广泛［3⁃4］。近年有研究表明，RES可以降低肿瘤多药耐药性，提高化疗敏感性［4⁃5］。本研究通过检测RES及其联合 5⁃FU对胃癌耐药细胞SGC⁃7901/5⁃FU的生物学效应，并初步探讨其作用机制。

1 材料与方法

1.1 主要材料与仪器

人胃癌细胞5⁃FU耐药株（SGC⁃7901/5⁃FU细胞株）购自北纳生物；5⁃FU购自齐鲁制药有限公司；RES（纯度＞98%）购自杭州华安生物技术有限公司；TRIzolTMReagent购自Invitrogen公司；POWER SYBR GREEN PCR MASTER购自Applied Biosystems公司；ReverTra Ace qPCR RT Kit购自TOYOBO公司；GAPDH抗体购自Proteintec公司；多药耐药基因1（multi⁃drug resistance gene 1，MDR1），P⁃糖蛋白（P⁃glycoprotein，P⁃gp）、Bcl2和Caspase 3抗体购自Abcam公司；Annexin V⁃FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒（C1062S）、TUNEL细胞凋亡检测试剂盒（C1091、Cell Counting Kit⁃8、C0037）均购自Beyotime公司；实时定量PCR仪购自ABI公司；FACS Calibur购自BD Bioscience公司；倒置荧光显微镜OLYMPAS IX71购自OLYMPAS公司。

1.2 细胞培养与分组

从液氮罐取出装有SGC⁃7901/5⁃FU细胞的冻存管，放入37℃水浴锅中复苏，800 r/min离心5 min，弃上清液，加入含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基重悬细胞团，转移至10 cm2培养皿中，于37℃、5% CO2培养箱中培养。每72 h更换1次培养基，待细胞融合度达70%～80%后，胰蛋白酶消化，并按1∶3的比例进行传代培养。收集对数生长期细胞，96孔板中每孔加入200 μL的2.0×105/mL浓度细胞，于37 ℃、5% CO2培养箱中培养24 h，然后进行不同的加药处理。实验分为不同浓度（浓度依次为 0 μmol/L、10 μmol/L、50 μmol/L、200 μmol/L、400 μmol/L）RES 组、5⁃FU 组（5 μmol/L 5⁃FU单独作用）和联合组（RES与5⁃FU联用）。

1.3 CCK⁃8检测SGC⁃7901/5⁃FU细胞增殖能力

采用不同浓度（0 μmol/L、10 μmol/L、50 μmol/L、200 μmol/L、400 μmol/L）RES作用 SGC⁃7901/5⁃FU细胞24 h、48 h与72 h，以及RES与5⁃FU单独或联合作用细胞48 h后进行CCK⁃8实验。每孔中加入10 μL CCK⁃8溶液，在培养箱中孵育2 h，使用酶标仪测量450 nm处光密度（OD）值，计算不同处理组细胞抑制率，抑制率=［1-（实验组OD-空白组OD）/（对照组OD-空白组OD）］×100%。

1.4 流式细胞术检测SGC⁃7901/5⁃FU细胞凋亡能力

将对数生长期的空白对照组、RES组、5⁃FU组及联合组 SGC⁃7901/5⁃FU细胞，胰酶消化，PBS洗涤，然后用细胞计数仪计数后，根据Annexin V⁃FITC/PI试剂盒说明书，取5×105个细胞，加入适量195 μL AnnexinV⁃FITC 结合液，再分别加入 5 μL Annexin V⁃FITC溶液与10 μL碘化丙啶染色液，轻轻混匀，室温孵育15 min，转移至上样管中，用流式细胞仪检测细胞待测表面抗原的表达。

1.5 Tunel免疫荧光实验检测SGC⁃7901/5⁃FU细胞形态

空白对照组、RES组、5⁃FU组以及联合组SGC⁃7901/5⁃FU细胞用4%多聚甲醛固定10 min，避光条件下，加入Tunel溶液于37℃孵育60 min，最后加入DAPI溶液封片。荧光显微镜下观察细胞凋亡数量及形态变化。

1.6 RT⁃PCR检测SGC⁃7901/5⁃FU细胞中MDR1、Bcl2和Caspase 3 mRNA的表达

收集各组细胞，用TRIzol试剂盒提取细胞总RNA，测定其纯度和浓度，按照逆转录试剂盒说明书用逆转录酶将其合成cDNA。以cDNA为模板，GAPDH作为内参，对MDR1、Bcl2和Caspase 3基因进行RT⁃PCR。反应体系为20 μL，反应条件：95℃DNA聚合酶激活20 s，95 ℃变性3 s、60 ℃退火/延伸30 s，共40个循环。RT⁃PCR实验数据结果采用2-△△Ct进行分析。实验重复3次。引物序列见表1。

表1 RT⁃PCR的引物序列Tab.1 Sequences of primers for RT⁃PCR

1.7 Western blot检测SGC⁃7901/5⁃FU细胞中P⁃gp、Bcl2和Caspase 3蛋白的表达

收集各组细胞，用BCA试剂盒测定提取的蛋白浓度，制备10%的SDS⁃PAGE胶，电泳分离，转至PVDF膜，5%脱脂奶粉封闭2 h，加入待测一抗P⁃gp（稀释浓度为1∶500）、Bcl2（稀释浓度为1∶1 000）与Caspase 3（稀释浓度为1∶2 000），于4℃摇床上孵育过夜。第二天加入相应浓度的二抗，于室温条件下孵育2 h。用TBST洗膜3次，每次5 min。在膜上加200 μL发光液（100 μL A液+100 μL B液），等待2 min后放入显影仪显影。实验重复3次。Image J软件分析条带的灰度值。

1.8 统计学方法

采用SPSS 13.0软件进行统计分析，计量资料采用均数±标准差（xˉ±s）表示，两组间比较采用独立t检验，多组间比较采用单因素方差分析，后续两两比较采用LSD⁃t，以双侧P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 RES对SGC⁃7901/5⁃FU细胞增殖的影响

CCK⁃8 实验结果显示，24 h 后，与 10 μmol/L相比，200 μmol/L与 400 μmol/L浓度RES作用后细胞增殖抑制率均升高（均P＜0.001）；48 h后，与 10 μmol/L相比，50 μmol/L、200 μmol/L与 400 μmol/L RES 作用后细胞增殖抑制率也升高（均P＜0.001）；72 h后，与10 μmol/L相比，50 μmol/L、200 μmol/L与400 μmol/L浓度的RES作用后细胞增殖抑制率明显提高（均P＜0.001），见图1。提示RES能够有效抑制SGC⁃7901/5⁃FU细胞增殖，且呈剂量与时间依赖性，其中（98.21±8.45）μmol/L浓度的RES作用细胞48 h后其抑制率达50%，因此本研究选择100 μmol/L RES进行后续实验。

图1 RES对SGC⁃7901/5⁃FU细胞增殖的抑制作用Fig.1 Inhibitory effect of RES on the proliferation of SGC⁃7901/5⁃FU cells

2.2 RES与5⁃FU联合对SGC⁃7901/5⁃FU细胞增殖的影响

CCK⁃8实验结果显示，100 μmol/L RES、5⁃FU单独或两者联合作用于SGC⁃7901/5⁃FU细胞48 h后，联合组的细胞增殖抑制率均较单独给药组高（均P＜0.001），见图2。

图2 RES与5⁃FU对SGC⁃7901/5⁃FU细胞增殖的影响Fig.2 Effect of RES and 5⁃FU on the proliferation of SGC⁃7901/5⁃FU cells

2.3 RES与5⁃FU联合对SGC⁃7901/5⁃FU细胞凋亡的影响

AnnexinV⁃FITC/PI细胞流式实验结果显示，100μmol/L RES、5⁃FU单独或两者联合作用SGC⁃7901/5⁃FU细胞48 h后，与对照组相比，各药物处理组细胞凋亡率均升高（均P＜0.001）；其中联合组凋亡率最高，见图3。

图3 RES与5⁃FU对SGC⁃7901/5⁃FU细胞凋亡的影响Fig.3 Effect of RES and 5⁃FU on the apoptosis of SGC⁃7901/5⁃FU cells

Tunel免疫荧光实验检测结果显示，各药物处理组细胞均出现明显凋亡现象，其中联合组Tunel阳性信号（核绿色荧光着色）明显增多，且核出现固缩、碎裂及变形等现象，见图4。

图4 RES与5⁃FU对SGC⁃7901/5⁃FU细胞形态的作用（40×）Fig.4 The representative images from the effects of RES and 5⁃FU on the morphology of SGC⁃7901/5⁃FU cells(40×)

2.4 RES联合5⁃FU对SGC⁃7901/5⁃FU细胞耐药及凋亡相关基因及蛋白表达的影响

RT⁃PCR与Western blot实验检测结果显示，100 μmol/L RES、5⁃FU 单独或联合作用于 SGC⁃7901/5⁃FU细胞48 h后，与对照组相比，RES组和联合组中MDR1 mRNA与P⁃gp蛋白表达水平均下降（P＜0.05），且联合组变化更明显；RES组、5⁃FU组及联合组中Bcl2 mRNA与蛋白表达水平均下降（P＜0.001），Caspase 3 mRNA与蛋白表达水平均上升（P＜0.001），其中联合组变化最明显。单独5⁃FU处理细胞时，MDR1 mRNA及P⁃gp蛋白表达水平变化不明显，见图5。

图5 RES与5⁃FU对SGC⁃7901/5⁃FU细胞中耐药及凋亡相关基因mRNA和蛋白的影响Fig.5 Effect of RES and 5⁃FU on mRNA and protein levels of drug⁃resistance and apoptosis⁃related genes in SGC⁃7901/5⁃FU cells

3 讨论

RES是一种从百合科藜芦属毛叶藜芦根部提取的多酚类化合物，具有广泛的药理作用，目前研究显示其对胃癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌等肿瘤细胞具有明显抑制作用，且能通过ATP结合盒（ABC）跨膜转运蛋白家族、信号传导通路、SIRTl、诱导细胞凋亡等作用机制降低肿瘤细胞对化疗药物的耐药性，逆转肿瘤多药耐药［5⁃13］。在胃癌研究中发现，RES能通过抑制肿瘤生长并诱导肿瘤细胞凋亡提高人胃癌阿霉素耐药细胞SGC7901/DOX对阿霉素的敏感性［14］。5⁃FU是胃癌常用的系统化疗药物，但目前鲜见RES对胃癌5⁃FU耐药细胞的报道，在5⁃FU耐药细胞中RES是否发挥同样作用尚未知。本研究采用不同浓度的RES处理胃癌耐药细胞SGC⁃7901/5⁃FU，发现各浓度RES均能抑制细胞增殖，并呈剂量与时间依赖性，且RES与5⁃FU联合作用后能更明显提高细胞增殖的抑制效率，诱导细胞凋亡，以及出现明显的凋亡样形态改变。说明RES与5⁃FU联合能够明显抑制胃癌耐药细胞生长，并促进耐药细胞凋亡。

通过激活信号通路对抗细胞凋亡是肿瘤细胞产生耐药性的一个重要因素，其中Bcl2和Caspase 3在细胞凋亡中发挥重要作用。当肿瘤细胞被药物作用而促使细胞凋亡时，线粒体膜上抗凋亡基因Bcl2的表达下降，从而促使细胞色素C等促凋亡蛋白从线粒体释放，激活Caspase 3［15］。有研究表明RES可通过上调Caspase 3与下调Bcl2表达促进人大肠癌奥沙利铂耐药细胞HCT116/OXA凋亡，从而逆转其耐药性［16］。本研究发现RES与5⁃FU不管是单独作用还是两药联合都能诱导SGC⁃7901/5⁃FU细胞凋亡，致使细胞形态出现核固缩、碎裂与变形等现象，而这可能是通过上调Caspase 3与下调Bcl2表达实现。

MDR1位于人7号染色体长臂，能够编码分子量为170 kD的细胞膜糖蛋白P⁃gp。P⁃gp是主要存在于细胞膜的ABC跨膜转运蛋白家族中最大的蛋白，能促使化疗药物泵出细胞而致使药物浓度下降，是肿瘤细胞产生多药耐药性的主要蛋白。既往研究表明MDR1表达与SGC⁃7901/5⁃FU细胞对5⁃FU的耐药性呈正相关［17⁃18］。MDR1与 P⁃gp以不同的表达水平存在于不同肿瘤类型中，但当肿瘤细胞对化疗药物产生耐药时，两者表达均升高，因此MDR1基因与P⁃gp蛋白常被作为肿瘤耐药的标志。已有研究表明，RES能在人乳腺癌阿霉素耐药细胞MCF⁃7/ADR与人口腔上皮癌耐药细胞系KBv200中通过下调MDR1基因和P⁃gp蛋白表达逆转细胞耐药性，提高其对化疗药物的敏感性［19⁃20］。本研究同样发现RES单药及其联合5⁃FU作用于SGC⁃7901/5⁃FU细胞后，MDR1 mRNA及P⁃gp蛋白表达水平均明显降低，提示RES可能通过调控MDR1表达并抑制P⁃gp的药物外排泵功能而提高胃癌细胞对化疗药物的敏感性。

综上所述，RES能通过下调多药耐药基因MDR1/P⁃gp蛋白表达而降低胃癌耐药细胞SGC⁃7901/5⁃FU的耐药性，从而抑制细胞增殖并诱导细胞凋亡，RES可能是胃癌增强化疗敏感性的药物。未来有望以RES联合给药等方式应用于胃癌治疗研究领域，从而逆转胃癌细胞因长期化疗而产生的多药耐药性，提高胃癌治疗效果。