LncRNA SNHG1靶向miR⁃101⁃3p调控胃癌细胞奥沙利铂耐药性

卞伟钢 陈平 周小宁 陈海婷 宋曙

胃癌是常见的消化系统恶性肿瘤，化疗是晚期胃癌患者的主要治疗方式，但有效率仅为40%，其中化疗药物耐药是影响疗效的主要原因之一［1⁃2］。因此，深入研究胃癌的耐药机制，有助于提高癌细胞对药物的敏感性，从而提高疗效。长链非编码RNA（lncRNA）是长度超过200 nt的非编码核苷酸片段。既往研究显示lncRNA异常表达与肿瘤发生及耐药性有关［3］。其中有研究报道长链非编码（lncRNA）核仁小RNA宿主基因 l（small nucleolar RNA host gene l，SNHGl）通过调控DNA甲基转移酶1（DNMT1）促进胃癌细胞增殖［4］。也有研究发现 miR⁃101⁃3p 在调控肿瘤细胞增殖、凋亡、迁移和分化中发挥重要作用，其异常表达与肿瘤耐药性有关［5］。FAN等［6］在胰管腺癌中过表达miR⁃101⁃3p发现能抑制核糖核酸还原酶M1（RRM1）表达，提高细胞对吉西他滨的敏感性。在非小细胞肺癌中上调lncRNA SNHG1表达可抑制miR⁃101⁃3p表达，激活Wnt/β⁃catenin信号通路从而参与非小细胞肺癌进展［7⁃8］。奥沙利铂（OXA）是胃癌化疗的主要组成药物之一，但目前胃癌奥沙利铂耐药的机制尚未清楚。本研究探讨lncRNA SNHG1对人胃癌细胞BGC⁃823奥沙利铂耐药性的影响及其是否通过靶向调控miR⁃101⁃3p发挥作用，以期为胃癌奥沙利铂耐药性提供新的研究方向。

1 材料与方法

1.1 主要材料与试剂

人胃癌细胞BGC⁃823购于中国科学院细胞库；奥沙利铂购自江苏恒瑞制药有限公司；si⁃SNHG1和si⁃NC由Thermo公司设计并合成；Trizol试剂、LipofectamineTM2000、双荧光素酶检测试剂盒购自美国Invitrogen公司；SNHG1、miR⁃101⁃3p、人类多药耐药基因（multi⁃drug resistance gene 1，MDR1）、U6、β⁃actin引物序列由上海生工生物工程有限公司设计并合成；RIPA裂解液、BCA试剂盒、ECL试剂盒、HRP标记羊抗兔IgG抗体等均购自上海碧云天生物技术有限公司；噻唑蓝（MTT）试剂盒、Annexin V/PI细胞凋亡试剂盒购自美国Invitrogen 公司；兔抗人P⁃gp、MRP、β⁃actin单克隆抗体购自美国Abcam公司。

1.2 细胞培养与转染

人胃癌耐药细胞株BGC⁃823/OXA由本实验前期建立。BGC⁃823/OXA细胞接种于10%胎牛血清的DMEM培养基中，在37℃、5% CO2培养箱中培养，待细胞生长至对数期时，按照LipofectamineTM2000试剂盒说明书进行转染。耐药细胞BGC⁃823/OXA分别转染SNHG1干扰RNA（si⁃SNHG1组）和阴性对照si⁃NC（si⁃NC组），空白对照组（Control组）不做转染处理。转染4 h后，更换新鲜培养基继续培养48 h，加入2 mg/mL Puromycin进行阳性克隆筛选。

1.3 BGC⁃823/OXA细胞对奥沙利铂的半数抑制浓度

收集si⁃SNHG1组和si⁃NC组对数生长期细胞，调整细胞浓度接种至96孔板中，每孔加入终浓度为1 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L、60 μmol/L的奥沙利铂，同时设置DMSO对照孔。培养48 h，每孔加入10 μL的MTT液，孵育4 h后再加入150 μL的DMSO溶液终止培养。用酶标仪检测490 nm处的光密度（OD）值，绘制生长曲线，计算奥沙利铂的半数抑制浓度（IC50）。

1.4 RT⁃qPCR实验检测lncRNA SNHG1、miR⁃101⁃3p及MDR1 mRNA表达水平

根据RNA提取试剂盒，提取各组细胞中的总RNA，合成cDNA后进行PCR扩增。反应体系共15 μL：上下游引物各 1.5 μL，cDNA 模板 0.5 μL，SYBR Primix Ex TaqTM 8 μL，ddH2O补充至15 μL；PCR反应条件：95℃变性30 s，60℃退火45 s，72℃延伸10 s，进行38个循环。miR⁃101⁃3p以U6为内参，lncRNA SNHG1、MDR1以β⁃actin为内参，采用2-△△Ct法计算目的基因相对表达量。引物序列见表1。

表1 引物序列Tab.1 The primer sequences

1.5 MTT法检测细胞增殖能力

转染si⁃NC、si⁃SNHG1后的BGC⁃823/OXA细胞分别用 10 μmol/L奥沙利铂处理，记为si⁃NC+OXA 组、si⁃SNHG1+OXA组，以不加奥沙利铂的DMSO溶液作为空白对照组。以每孔5×104个细胞接种于96孔板中，培养24 h后，每孔加入10 μL的MTT溶液，孵育4 h，再加入150 μL的DMSO溶液终止培养。用酶标仪检测490 nm处的光密度（OD）值，并计算细胞存活率。细胞存活率（%）=（实验组OD/空白对照组OD）×%。

1.6 流式细胞术检测细胞凋亡能力

si⁃NC+OXA组和si⁃SNHG1+OXA组细胞分别接种于96孔板中培养24 h后，每孔加入5 μL的Annexin⁃V⁃FITC和10 μL的PI，室温避光孵育30 min后，流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

1.7 Western blot检测P⁃gp、MRP蛋白的表达水平

收集各组细胞，提取总蛋白并检测蛋白浓度，取10 μg蛋白经电泳、转膜、封闭后，加入一抗P⁃gp、MRP和β⁃actin（稀释浓度均为1∶500），4 ℃孵化过夜；次日加入HRP标记二抗（稀释浓度为1∶200），室温孵育1 h，使用ECL试剂盒暗室曝光显影，分析蛋白条带灰度值。

1.8 双荧光素酶报告基因检测实验

用 starBase v2.0（http：//starbase.sysu.edu.cn/star⁃base2/browseNcRNA.php）预测到 lncRNA SNHG1和miR⁃101⁃3p有靶标位点，根据GeneBank中人SNHG1 3′UTR序列设计引物，PCR扩增后，将片段整合到pMIR⁃REPORTTM Luciferase质粒中，获得 SNHG1 3′UTR⁃荧光素酶报告载体 SNHG1⁃wt和 SNHG1⁃mut质粒。BGC⁃823细胞培养24 h 后，取上述质粒0.5 μg，分别与 miR⁃101⁃3p⁃mimics、miR⁃101⁃3p⁃NC 共转染BGC⁃823 细胞 24 h，分为 SNHG1⁃wt+miR⁃101⁃3p⁃NC组、SNHG1⁃wt+miR⁃101⁃3p⁃mimics组、SNHG1⁃mut+miR⁃101⁃3p⁃mimics组和 SNHG1⁃mut+miR⁃101⁃3p⁃NC组，根据说明书制备细胞提取物，测定各组荧光素酶活性。

1.9 统计学方法

采用SPSS 22.0软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差（x±s）描述，多组间比较使用单因素方差分析，进一步两组间比较采用SNK⁃q检验，以双侧P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 BGC⁃823/OXA细胞中lncRNA SNHG1和miR⁃101⁃3p的表达

RT⁃qPCR 实验结果显示，与BGC⁃823细胞相比，耐药细胞BGC⁃823/OXA中lncRNA SNHG1表达水平升高（1.97±0.21vs1.03±0.18，P＜0.001），miR⁃101⁃3p表达水平降低（0.54±0.07vs0.96±0.10，P＜0.001），见图1。

图1 RT⁃qPCR实验检测BGC⁃823/OXA细胞中lncRNA SNHG1、miR⁃101⁃3p的表达水平Fig.1 Expression of lncRNA SNHG1,miR⁃101⁃3p in BGC⁃823/OXA cells detected by RT⁃qPCR

2.2 转染si⁃SNHG1后BGC⁃823/OXA细胞中奥沙利铂的IC50

si⁃SNHG1转染BGC⁃823/OXA 细胞24 h后，奥沙利铂的IC50为10 μmol/L，低于si⁃NC组的IC50（22 μmol/L），见图2。故采用10 μmol/L奥沙利铂进行后续实验。

图2 不同浓度奥沙利铂对BGC⁃823/OXA细胞活性的影响Fig.2 Effect of different concentrations of oxaliplatin on the viability of BGC⁃823/OXA cells

2.3 RT⁃qPCR实验鉴定BGC⁃823/OXA细胞转染效果

与Control组和si⁃NC组相比，si⁃SNHG1组lncRNA SNHG1（0.47±0.09vs1.13±0.19，P＜0.001；0.47±0.09vs1.01±0.16，P＜0.001）、MDR1（0.52±0.08vs1.05±0.13，P＜0.001；0.52±0.08vs0.98±0.11，P＜0.001）表达水平降低，miR⁃101⁃3p表达水平升高（2.15±0.22vs1.01±0.19，P＜0.001；2.15±0.22vs1.04±0.21，P＜0.001），见图3。

图3 RT⁃qPCR实验检测BGC⁃823/OXA细胞的转染效果Fig.3 The transfection effect of BGC⁃823/OXA cells detected by RT⁃qPCR

2.4 lncRNA SNHG1与miR⁃101⁃3p的靶向关系验证

starBase数据库预测显示，lncRNA SNHG1与miR⁃101⁃3p 3′UTR区有结合位点，见图4A。双荧光素酶报告基因检测结果显示，SNHG1⁃wt+miR⁃101⁃3p⁃mimics组荧光素酶活性低于SNHG1⁃wt+miR⁃101⁃3p⁃NC组（0.21±0.06vs0.88±0.09，P＜0.001），见图4B。表明lncRNA SNHG1与miR⁃101⁃3p存在靶向关系。

图4 LncRNA SNHG1与miR⁃101⁃3p的靶向关系Fig.4 Targeting relationship between lncRNA SNHG1 and miR⁃101⁃3p

2.5 敲减SNHG1对BGC⁃823/OXA细胞增殖能力的影响

MTT 实验结果显示，与 si⁃NC组相比，si⁃SNHG1组BGC⁃823/OXA细胞存活率降低［（85.42±1.78）%vs（97.35±1.26）%，P＜0.001］；与 si⁃NC+OXA 组相比，si⁃SNHG1+OXA 组BGC⁃823/OXA细胞存活率降低［（47.25±1.24）%vs（72.36±1.43）%，P＜0.001］，见图5。

图5 MTT实验检测敲减SNHG1后BGC⁃823/OXA细胞的增殖能力Fig.5 Proliferation ability of BGC⁃823/OXA cells after knocking down SNHG1 detected by MTT assay

2.6 敲减SNHG1对BGC⁃823/OXA细胞凋亡的影响

流式细胞术检测结果显示，si⁃SNHG1组BGC⁃823/OXA细胞凋亡率高于si⁃NC组［（18.41±2.59）%vs（3.56±0.87）%，P＜0.001］；si⁃SNHG1+OXA 组 BGC⁃823/OXA细胞凋亡率高于si⁃NC+OXA组［（46.72±3.95）%vs（26.58±3.12）%，P＜0.001］，见图6。

图6 流式细胞术检测敲减SNHG1后BGC⁃823/OXA细胞的凋亡情况Fig.6 Apoptosis of BGC⁃823/OXA cells after knocking down SNHG1 detected by flow cytometry

2.7 敲减SNHG1后BGC⁃823/OXA细胞中P⁃gp、MRP蛋白的表达水平

Western blot检测结果显示，与si⁃NC组比较，si⁃SNHG1组BGC⁃823/OXA细胞中P⁃gp、MRP蛋白表达降低（1.01±0.12vs0.85±0.09，P=0.026；1.12±0.13vs0.95±0.11，P=0.035）；与 si⁃NC+OXA 组相比，si⁃SN⁃HG1+OXA组BGC⁃823/OXA细胞中P⁃gp、MRP蛋白表达水平降低（0.98±0.10vs0.62±0.05，P＜0.001；1.09±0.12vs0.57±0.08，P＜0.001），见图7。

图7 Western blot检测敲减SNHG1后BGC⁃823/OXA细胞中P⁃gp、MRP蛋白的表达Fig.7 Expression of P⁃gp and MRP protein in BGC⁃823/OXA cells after knocking down SNHG1 detected by Western blot

3 讨论

奥沙利铂具有抗癌谱广、溶解性和稳定性良好等优点，常用于晚期胃癌治疗［9］。肿瘤多药耐药是影响胃癌治疗疗效的主要原因之一。既往研究表明lncRNA 参与胃癌耐药［10⁃11］。其中，有研究显示lncRNA SNHG1在结直肠癌、肝癌、胃癌、骨肉瘤等多种肿瘤中异常表达，且SNHG1上调与肿瘤大小、TNM分期和总生存率降低相关［12］。LIU等［13］研究表明，lncRNA SNHG1在胃癌细胞中高表达，且通过调节miR⁃15b/DCLK1/Notch1轴促进胃癌细胞的上皮间质转化。近年研究还发现lncRNA SNHG1与癌细胞耐药有关，如 LI等［14］报道 lncRNA SNHG1通过上调miR⁃21表达激活Akt通路，从而促进肝癌细胞索拉非尼耐药。SHI等［15］发现lncRNA SNHG1在耐顺铂的非小细胞肺癌组织和细胞系中表达上调，SNHG1敲低可抑制非小细胞肺癌细胞增殖、迁移、侵袭及对顺铂的抗性，且可能通过miR⁃140⁃5p/Wnt/β⁃catenin途径促进非小细胞肺癌的顺铂耐药性。本研究发现在胃癌耐药细胞BGC⁃823/OXA中lncRNA SNHG1的表达水平升高，提示SNHG1可能与BGC⁃823细胞耐药有关。si⁃SNHG1转染BGC⁃823/OXA 细胞24 h后，奥沙利铂的IC50约为 10 μmol/L，低于 si⁃NC 组的 IC50，且细胞增殖活性降低，而细胞凋亡率增加，表明敲减SNHG1后BGC⁃823细胞对OXA的敏感性增强。

MDR1定位于第7号染色体的长臂上，而P⁃gp是MDR1编码的转运蛋白，能将药物泵出细胞外，也是肿瘤耐药性标志物［16］。MRP是多药耐药形成的机制之一，也是肿瘤化疗失败的主要原因，而MRP主要通过介导抗癌药物转运形成耐药［17］。本研究发现敲减SNHG1 后 BGC⁃823/OXA 细胞中 MDR1、P⁃gp、MRP表达水平降低，表明敲减SNHG1表达可以降低细胞耐药性。同时敲减SNHG1后的BGC⁃823/OXA细胞使用10 μmol/L奥沙利铂处理，结果细胞存活率及P⁃gp、MRP蛋白表达水平均降低，而细胞凋亡率增加，进一步证实干扰SNHG1表达可降低细胞耐药性。

研究表明miR⁃101⁃3p在大部分肿瘤中低表达，与肿瘤耐药有一定相关性，而在肺癌中过表达miR⁃101⁃3p有助于提高细胞对顺铂的敏感性［18］。SUN等［19］报道在肝癌耐药组织与细胞中miR⁃101⁃3p低表达，且miR⁃101⁃3p可以通过抑制Beclin⁃1介导的自噬增强肝细胞癌细胞对奥沙利铂的敏感性。LI等［20］研究表明，在顺铂耐药膀胱尿路上皮癌（BUC）细胞系（T24/CDDP）和组织中miR⁃101⁃3p表达下调，且与BUC对顺铂的敏感性呈正相关，而miR⁃101⁃3p可能通过靶向沉默EZH2提高BUC对顺铂的敏感性。本研究发现miR⁃101⁃3p在BGC⁃823/OXA细胞中低表达，转染si⁃SNHG1后，BGC⁃823/OXA 细胞中 miR⁃101⁃3p 表达升高，提示 miR⁃101⁃3p与BGC⁃823细胞奥沙利铂耐药性可能有关。经starBase数据库预测，lncRNASNHG1与miR⁃101⁃3p 3′UTR区存在结合位点，且双荧光素酶基因检测报告证实lncRNA SNHG1与miR⁃101⁃3p存在靶向关系，表明lncRNA SNHG1可能通过靶向调控miR⁃101⁃3p表达而参与BGC⁃823/OXA的耐药性。

综上，lncRNA SNHG1在胃癌奥沙利铂耐药细胞中高表达，且可能通过靶向调控miR⁃101⁃3p促进奥沙利铂耐药性。本研究结果为进一步研究胃癌奥沙利铂耐药机制提供了新的思路，lncRNA SNHG1可能是胃癌潜在的分子靶点。