姜黄素对妊娠高血压大鼠急性肾损伤的保护作用

杨明凤冉利梅*

(1.贵州医科大学公共卫生学院,贵阳 550004; 2.黔南州妇幼保健院,贵州黔南 558000)

急性肾损伤(acute kidney injury,AKI)是一种临床综合征,主要表现为肾功能快速下降[1]。 大量研究报告了不同研究人群和临床环境中AKI 的发生率、风险特征和转归[2-3]。 对于妇女而言,怀孕是一种独特的状态, 在这种状态下, 妊娠高血压(pregnancy induced hypertension,PIH)引起的肾疾病可能会同时影响产妇和后代的肾健康。 AKI 是妊娠期间罕见但严重的并发症,与不良结局的风险增加息息相关[4],其病理生理基础及其并发症包括炎症,氧化应激和细胞凋亡[5]。 姜黄(Curcumin,Cur)是一种传统药物,主要用于治疗各种疾病,例如风湿病,糖尿病性溃疡,厌食症,咳嗽和鼻窦炎[6]。 据报道,姜黄素抗炎,抗氧化,抗癌,和抗感染等[7-8]广泛的治疗作用。 姜黄素可以调节酶、细胞因子、转录因子、生长因子、受体、微核糖核酸、信号分子和活性氧,从而对炎症和氧化应激产生积极影响。 姜黄素可以钝化炎症分子的产生或作用并减轻肾病的进程。 因此,本研究将以妊娠高血压大鼠为模型,探讨姜黄素对急性肾损伤的保护效果,并试图阐明其分子机制,为妊娠高血压急性肾损伤的药物开发提供思路。

1 材料和方法

1.1 实验动物

Sprague-Dawley 雄性大鼠(230~300 g,4 只)和雌性大鼠(210~280 g,36 只)(SPF 级)(8~10 周龄)购买自贵州医科大学实验动物中心[SCXK(黔)2018-0001]。 所有动物均饲养在贵州医科大学实验动物中心的动物房中[SYXK(黔)2018-0023],房间在22℃~25℃保持恒温,并提供充足的食物和饮用水。 第2 天,进行阴道涂片检查精子。 观察到许多精子细胞则表明发生成功性交。 发现精子的首日算为怀孕的第0 天。 本实验总共选择了32 只妊娠大鼠用于实验。 动物实验遵循3R 原则,并得到了贵州省人民医院动物伦理委员会的批准(IACUC-20180604-01)。 所有实验程序均严格遵循国际疼痛研究协会的动物保护原则执行。

1.2 主要试剂与仪器

姜黄素(西格玛,美国圣路易斯);NG-硝基-L-精氨酸甲酯(L-NAME,西格玛,美国圣路易斯);凋亡检测试剂盒(Promega,Madison,WI);抗 TGF-β1(sigma,圣路易斯,密苏里州);抗 p-Smad3 和抗Smad3(Cell Signaling Technology,Beverly,MA);抗GAPDH(SantaCruz Biotechnology);NG-硝基-L-精氨酸甲酯(L-NAME,西格玛,美国圣路易斯)。

临床自动生化分析仪7600(日立,日本);光学显微镜(Leica DM3000LED,德国)。

1.3 实验方法

1.3.1 实验分组

选择32 只怀孕的Sprague-Dawley 雌性大鼠,随机均分为四组:正常组、姜黄素组、PIH 组和PIH+姜黄素组。 从妊娠第14 天开始,正常组和姜黄素组大鼠每天连续静脉注射尾静脉0.8 mL 生理盐水,连续4 d,而PIH 组和PIH+姜黄素组大鼠则每天注射26 mol/L NG-硝基-L-精氨酸甲酯以诱导PIH 模型,连续4 d。 在怀孕的第14 和17 天,测量各组的收缩压。 观察到收缩压增加30 mmHg 以上,则认为成功建立了PIH 模型大鼠,并在第18 天选择了该模型进行干预治疗。 姜黄素组和PIH+姜黄素组大鼠自第18 天起,喂食姜黄素204.8 mol/L(悬浮在2%CMC 中),持续 7 d[9]。

1.3.2 临床自动生化分析仪检测肾肾功能和氧化应激水平

使用临床自动生化分析仪7600 测量大鼠肾组织中的血尿素氮、肌酐、24 h 尿白蛋白排泄率和肌酐清除率。 使用Roche Diagnostics(曼海姆,德国)提供的套件检测大鼠肾组织中丙二醛(malondialdehyde ,MDA)和一氧化氮(NO)水平。

1.3.3 组织病理学方法评估肾肾损伤

将肾组织固定在4%中性低聚甲醛溶液中,包埋石蜡,切成4 μm 切片,并用苏木精-伊红染色。在光学显微镜下(Leica DM3000LED,德国)检查整个冠状切片,并根据损伤程度根据肾受累百分比进行分级。 使用以下参数对肾组织对应的10 个区域的损伤定量进行分级:肾小管细胞坏死,凋亡,胞质液泡形成,出血和肾小管扩张(1,组织病理学变化<10%;2,10%~25%;3,25%~50%;4,50%~75%;5,75%~100%)[10]。 计算每个大鼠的平均得分,并进行统计分析。

1.3.4 免疫荧光染色法检测caspase-3 的活化

在4%多聚甲醛中将3 μm 厚度的肾切片固定15 min,然后在室温下用0.2% TritonX-100 的PBS透化5 min。 用2%驴血清封闭60 min 后,将玻片用抗裂解的 caspase-3(目录号:9664,Cell Signaling Technology,Beverly,MA)的一抗进行免疫染色。 然后将载玻片用 TRITC 缀合的第二抗体染色。 用Nikon Eclipse 80i Epifluorescence 显微镜观察并拍照。 用Image J 进行灰度值分析并统计。

1.3.5 末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP 缺口末端标记(TUNEL)染色检测凋亡

通过使用凋亡检测系统(Promega,Madison,WI)使用末端环氧核苷酸转移酶介导的dUTP 缺口末端标记染色来确定凋亡细胞的死亡。 阳性细胞用FITC 标记,记录每个视野中的阳性细胞数并进行统计分析。

1.3.6 免疫组织化学法分析TGF-β1 和p-Smad3的表达和分布

将4 μm 石蜡包埋切片去石蜡并在柠檬酸盐缓冲液(0.01 mol/L,pH 6.0)中加热;然后将切片置于3%过氧化氢中,并与TGF-β1 和p-Smad3 的一级抗体(1 ∶200;Cell Signaling Technology) 在 4℃ 孵育过夜。 将切片与相应的二抗在37℃下孵育30 min。使用3,3-二氨基联苯胺四盐酸盐显色,并用苏木精复染色核。 用 Nikon Eclipse 80i Epifluorescence 显微镜观察并拍照。

1.3.7 蛋白质印迹法检测 TGF-β1、p-Smad3 和Smad3 的表达

将肾组织用含有1% NP40、0.1% SDS,100 mg/mL PMSF,1%蛋白酶抑制剂混合物以及1%磷酸酶I和II 抑制剂混合物(Sigma,圣路易斯,密苏里州)的RIPA 溶 液 溶 解。 在 4℃ 下 以 13000 r/min 离 心30 min后收集上清液。 通过二辛可宁酸蛋白质测定法测定蛋白质浓度。 将等量的蛋白质上样到10%或15% SDS-PAGE 中,然后转移到聚偏二氟乙烯膜上。 一抗如下:抗 TGF-β1(Sigma,圣路易斯,密苏里州), 抗 p-Smad3 和 抗 Smad3 ( Cell Signaling Technology, Beverly, MA), 抗 GAPDH (SantaCruz Biotechnology)。 视野 National Health Institute 图像软件包测量信号强度,并进行定量分析。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 姜黄素对妊娠高血压大鼠的肾功能的影响

如图1 所示,与正常对照组和姜黄素组相比,PIH 组大鼠的血肌酐、尿素氮和尿白蛋白/肌酐比显著升高(P<0.001),肌酐清除率则显著下降(P<0.001)。 姜黄素治疗可以使血肌酐、尿白蛋白/肌酐比显著回落(P<0.01),而肌酐清除率则有效改善(P<0.01)。 这些结果表明姜黄素可以改善妊娠高血压大鼠的肾功能损伤。

图1 不同组大鼠的肾功能变化( ,n=8)Note. A, Blood creatinine. B, Blood urea nitrogen. C, Urinary albumin/creatinine ratio. Compared with Con group,***P <0.001. Compared with PIH group,##P <0.01.Figure 1 Renal function changes in different groups of rats

2.2 姜黄素对PIH 大鼠肾小管的组织病理学的影响

与正常对照组和姜黄素组的肾组织相比,PIH组大鼠肾肾小管显著扩张,肿胀,管腔充血和核固缩,甚至部分区域发生变性,姜黄素治疗可以有效减轻上述变化(图2A)。 与组织学观察相一致,在用姜黄素治疗的大鼠组织病理学损伤的总评分显著降低(P<0.01)(图2B)。

图2 组织病理学水平观察各组大鼠肾损伤( ,n=8)Note. A, Hematoxylin-eosin stained kidney section. B, Histopathological scores of rats in each group. Compared with Con group,***P <0.001. Compared with PIH group,##P <0.01.Figure 2 Histopathological observation of kidney injury in each group

2.3 姜黄素对PIH 大鼠肾中的肾小管细胞凋亡和氧化应激的影响

肾小管细胞凋亡是PIH 诱导的急性肾损伤的关键环节。 在这项研究中,我们通过TUNEL 染色法和cleaved caspase-3 免疫染色来观察肾小管细胞的凋亡水平。 如图3A~3C 所示,在对照或姜黄素组的大鼠的肾组织中,几乎没有检测到凋亡细胞,cleaved caspase-3 染色也是阴性的。 但是,PIH 诱导的AKI 大鼠肾中, TUNEL 染色阳性和 cleaved caspase-3 免疫染色阳性的细胞数量显著增加,而姜黄素治疗后,细胞凋亡显著减少(P<0.01)。 为了评估姜黄素在PIH 大鼠肾氧化应激中的作用,我们在肾组织中检测了MDA 和NO 的水平。 如图3D~3E所示,与 PIH 组相比,PIH+Cur 组的 MDA 和 NO含量均显著下降(P<0. 01)。 这些结果,表明姜黄素可以减轻妊娠高血压诱导的大鼠肾小管细胞凋亡和氧化应激。

图3 姜黄素可以减少PIH 大鼠肾中的肾小管细胞凋亡并减轻氧化应激水平( ,n=8)Note. A, Representative pictures of TUNEL staining and immunostaining images of lysed caspase3 of rats in each group. B, Quantitative analysis of the number of TUNEL staining positive cells in each group of rats. C, Quantitative analysis of the number of clear-caspase 3 staining positive cells in each group of rats. D,The content of MDA in the kidneys of rats in each group. E,NO content in the kidneys of rats in each group. Compared with Con group,***P <0.001. Compared with PIH group,#P <0.05,##P <0.01.Figure 3 Curcumin can reduce renal tubular cell apoptosis and reduce the level of oxidative stress in PIH rat kidneys

2.4 姜黄素对PIH 大鼠肾中TGF-β1 和p-Smad3的影响

如图4 所示,与正常对照和姜黄素组相比,PIH组的TGF-β1 和p-Smad3 的表达水平显著升高(P<0.001)。 而姜黄素治疗组的 TGF-β1 和 p-Smad3 的水平显著降低(P<0.01),同时,蛋白质免疫印迹实验结果显示,姜黄素治疗后,大鼠肾Smad3 的表达并没有显著改变。 以上结果表明,用姜黄素治疗可显著逆转 PIH 大鼠肾中 TGF-β1 和 Smad3 的表达水平。

图4 姜黄素对PIH 大鼠肾转化生长因子-β1(TGF-β1)和smad3 表达和分布的影响( ,n=8)Note. A, Immunohistochemical staining was used to observe the expression and distribution of TGF-β1 and p-smad3 in rat kidney slices. B,Western blot was used to detect the expression levels of TGF-β1,p-smad3 and smad3 in rat kidney. C,Analysis of relative gray value of TGF-β1. D, The ratio of p-smad3/smad3. Compared with Con group,***P <0.001. Compared with PIH group,##P <0.01. TGF-β1:Transforming growth factor-β1.Figure 4 Effect of curcumin on the expression and distribution of transforming growth factor-β1 (TGF-β1) and smad3 in PIH rats kidney

3 讨论

我们的研究发现,PIH 大鼠血肌酐、血尿素氮、24 h 尿白蛋白排泄率显著增加,而肌酐清除率则显著下降,同时,PIH 诱导的AKI 导致大鼠肾组织学改变,包括肾小管显著扩张,肿胀,管腔充血和核固缩,甚至部分区域发生变性,这种肾损伤同时伴随氧化应激相关分子水平和肾小管上皮细胞凋亡率上升,并进一步加剧了肾损伤。 值得注意的是,应用姜黄素治疗后,大鼠的肾功各项指标均有所回落,组织学损伤减轻,氧化应激和细胞凋亡水平也均显著下降,这表明,姜黄素可以有效保护妊娠高血压大鼠的急性肾损伤。

到目前为止,妊娠高血压引起的急性肾损伤损伤的具体机理尚未完全阐明。 研究表明,PIH 引起的急性肾损伤的主要原因是肾氧自由基的增加,细胞内钙超载,能量代谢紊乱和激素分泌紊乱。 在这种复杂的病理生理过程中,氧化应激相关分子对肾组织的损害 AKI 的主要病原体之一[11]。 MDA 和NO 水平是氧化应激的两个主要指标[12]。 在我们的研究中发现,PIH 大鼠肾组织中MDA 和NO 升高,这表明存在氧化应激损伤。 同时,姜黄素可以通过抑制cleaved caspase-3 的活化来抑制凋亡,这进一步证实了姜黄素的抗凋亡作用。 炎症促进进行性肾损伤,并且TGF-β1 被认为是肾损伤进展的关键介质。 我们的结果表明,PIH 组中 TGF-β1 表达显著上调,但应用了姜黄素后其表达会显著下降。 因此,我们研究了Smad3 的磷酸化,发现姜黄素显著降低了Smad3 的磷酸化。 因此,姜黄素的肾保护作用与TGF-β1 信号通路的下调有关。 综上所述,我们的研究表明,姜黄素可显著改善PIH 引发的急性肾损伤,这是通过抑制TGF-β1 信号通路来实现的,由于姜黄素具有抗氧化和凋亡的作用,可以为临床药物开发提供参考。