神曲消食口服液对功能性消化不良小鼠胃肠运动的影响及机制

张丛敏朱晓静魏金铠李红亚李彩霞唐 卉靳晨晨赵永才

(保定市第一中心医院儿科,河北保定 071000)

神曲消食口服液是一种纯中药制剂,是著名儿科专家方鹤松教授研制出的临床验方,对儿童脾胃功能虚弱和饮食积滞导致的厌食、食欲不振及食量减少等有独特的药效[1]。 小儿功能性消化不良(functional dyspepsia,FD)是临床具有上腹痛、恶心、呕吐及胀气等症状,但排除器质性疾病的综合征,其病情多反复、迁延,严重影响患儿身心健康[2]。目前,临床治疗常以经验性治疗为主,西药治疗后往往会出现口苦、咽干等不良反应,导致患儿依从性较差,影响治疗效果[3]。 赵咏梅等[4]研究指出,神曲消食口服液对儿童功能性消化有较好的临床效果,可明显提高胃排空能力。 但神曲消食口服液制剂成分复杂,其安全性评价和具体作用机制的研究较少。 故本研究将观察神曲消食口服液对正常KM 小鼠血常规及肝肾功能的影响,并构建FD 模型小鼠,探究神曲消食口服液对FD 小鼠胃肠运动能力的影响,并初步分析其作用机制,旨在为神曲消食口服液的临床应用提供理论基础。

1 材料和方法

1.1 实验动物

95 只清洁级 KM 小鼠,雄性,6~8 周龄,28~32 g,购自河北省实验动物中心[SCXK(冀)2019-0010],动物实验于河北省实验动物中心开展[SYXK(冀)2019-0001]。 饲养环境:21℃ ~25℃恒温,相对湿度45% ~ 65%,昼夜明暗交替时间为12 h,各项操作符合动物实验的“3R”原则,经保定市第一中心医院医学伦理委员会审核通过([2018]004 号)。

1.2 主要试剂与仪器

神曲消食口服液(扬子江药业集团江苏龙凤堂中药有限公司,国药准字Z20153035,规格10 mL×6支,批号:201806);左旋精氨酸购自上海瑶韵生物科技有限公司,批号:180109;肝肾功能指标检测试剂盒购自北京利德曼生化股份有限公司;引物合成由上海茁彩生物科技有限公司提供;蛋白一抗及二抗购自美国Abcam 公司。 血常规分析仪购自日本光电工业株式会社,型号为6318K;全自动生化分析仪购自美国贝克曼库尔特公司,型号为 UniCal DxC800;荧光PCR 仪购自美国 Bio-Rad 公司,型号为CFX96。

1.3 实验方法

1.3.1 实验分组及给药

40 只KM 小鼠随机分为正常组、神曲消食口服液低、中及高剂量组,每组10 只,神曲消食口服液组分别灌胃0.1、0.2 及0.3 mL 神曲消食口服液(分别混以 0.2、0.1 及 0 mL 生理盐水),每天 1 次,连续灌胃30 d,正常组以同体积生理盐水替代。

1.3.2 血常规及肝肾功能检测

取血后,经血常规分析仪和全自动生化分析仪检测,血常规指标有:白细胞(white blood cells,WBC)、红细胞(red blood cells,RBC)、血红蛋白(hemoglobin,HGB)、血小板(platelet,PLT)、淋巴细胞 ( lymphocyte, LYM)、 单 核 细 胞 ( monocytes,MONO)及中性粒细胞(neutrophil,NEU),肝肾功能指标有: 天门冬氨酸氨基转移酶( aspartate aminotransferase,AST)、丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase,ALT)、总胆汁酸(total bile acid,TBA)、尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)及肌酐(creatinine,CRE)。

1.3.3 模型建立及给药

从55 只KM 小鼠中随机选出10 只作为正常组,剩余小鼠采用不规律进食+左旋精氨酸(L-Arg)法构建FD 动物模型,具体方法[5]:以2 d 进食,1 d禁食为一个循环单位,循环10 d;第11 天和第12 天时腹腔注射0.1 g/kgL-Arg;正常组小鼠正常进食,腹腔注射以同体积生理盐水替代。 造模结束后随机选取5 只小鼠处死,检测其胃排空率及小肠推进率降低,则判断FD 模型复制成功,再将剩余40 只模型小鼠随机分为模型组、神曲消食口服液低、中及高剂量组,每组10 只;神曲消食口服液组分别灌胃0.1、0.2 及0.3 mL 神曲消食口服液(分别混以0.2、0.1 及 0 mL 生理盐水),每天 1 次,连续灌胃 14 d;正常组和模型组以同体积生理盐水替代,观察各组小鼠体重的变化。

1.3.4 胃排空及肠推进功能检测

末次给药后禁食24 h,每只0.5 g 的碳末半固体糊(5 g 羧甲基纤维素、8 g 奶粉、4 g 糖、4 g 淀粉及1 g 活性炭混于128 mL 水)灌胃;处死小鼠,取胃组织称重,计为胃全重;剪开胃组织清除胃内容物后称量,计为胃净重;胃排空率=[1-(胃全重-胃净重)/固体糊状物重]×100%;取出完整小肠组织(胃部幽门切迹至碳糊最前端),测量其全长,小肠推进率=(胃部幽门切迹至碳糊最前端的距离/小肠全长)×100%。

1.3.5 HE 染色

将胃组织固定于4%多聚甲醛溶液中过夜,经常规HE 染色后,光学显微镜下观察胃组织病理学改变,并拍照。

1.3.6 qRT-PCR 检测

取适量小鼠胃组织,加入液氮研磨成粉末;加入适量RNAiso Plus,冰上静置6 min,以12000 r/min离心6 min;以氯仿-异丙醇体系,提取总RNA;纯度分析后,按照逆转录试剂盒说明书,合成cDNA 模板;加入SYBR Premix 进行 qRT-PCR 检测,参数设置:95℃ 30 s,95℃ 5 s,60℃ 60 s,72℃ 1 min,共 39个 循 环。 GAPDH 上 游 引 物 5′-CGCTAACATCAAATGGGGTG-3′, 下 游 引 物 5 ′ -TTGCTGACAATCTTGAGGGAG-3′; 肌 醇 需 求 酶 1(Inositol requirement enzyme 1,IREl) 上游引物 5′-GGAGACCCTACGCTATTTGACCT-3′, 下 游 引 物 5′-TTGCTGACAATCTTGAGGGAG-3′;肿瘤坏死因子受体相关因子 2 ( Tumor necrosis factor receptorassociated factor 2, TRAF2 ) 上 游 引 物 5′-CGCGGATCCATGGCTGCAGCTAGCGTG-3′, 下 游 引物 5′-CGCTCTAGATTAGAGCCCTGTCAGGTCCTRA-3′[6]。 按照 2-△△CT法,以 GADPH 为内参,计算 IREl和TRAF2 mRNA 的相对表达量。

1.3.7 Western blot 检测

取适量小鼠胃组织,加入液氮研磨成粉末;加入适量RIPA 裂解液,冰上匀浆40 min,以12000 r/min 离心 10 min,提取胃组织总蛋白;取 50 μg 上样,进行恒压电泳(80 V~110 V);再300 mA 恒流转膜后,室温下封闭1 h;4℃下蛋白一抗过夜,β-actin稀释比为 1 ∶1000,IREl 稀释比为 1 ∶500,TRAF2 稀释比为1 ∶500;室温下蛋白二抗孵育30 min,稀释比为1 ∶10000;调整曝光条件,暗室中进行显影、定影;扫描胶片,经Image J 软件灰度分析后,以β-actin 为内参,计算胃组织中IREl 和TRAF2 蛋白的相对表达量。

1.4 统计学方法

采用SPSS 17.0 软件进行分析,数据以平均数±标准差()表示,多组均数比较采用单因素方差分析,组内两两比较采用LSD-t法,以P<0.05 表示组间差异有统计学意义。

2 结果

2.1 血常规情况

各组小鼠血常规指标比较,组间差异无统计学意义(P>0.05),提示神曲消食口服液给药对小鼠血常规各指标无影响,见表1。

表1 各组小鼠血常规指标的比较(n=10)Table 1 Comparison of blood routine indexes among all groups

2.2 肝肾功能情况

各组小鼠肝肾功能指标比较,组间差异无统计学意义(P>0.05),提示神曲消食口服液给药对小鼠肝肾功能指标无影响,见表2。

表2 各组小鼠肝肾功能指标的比较(n=10,U/L)Table 2 Comparison of liver and kidney function indexes among all groups

2.3 一般情况及体重变化的比较

造模初期(1 周内),各组小鼠发育良好,活动度高。 造模1 周之后,模型组小鼠逐渐出现靠边扎堆、活动度降低,毛发杂乱失去光泽,体重降低,但神曲消食口服液组小鼠上述表现较轻。 造模结束时,与正常组比较,其他组别小鼠体重增长更缓慢(P<0.05);干预结束时,与正常组比较,其他组别小鼠体重增长更缓慢(P<0.05),但与模型组比较,神曲消食口服液高剂量组体重增长加快(P<0.05),提示神曲消食口服液给药可促进小鼠体重增长,提高其活动度,见表3。

表3 各组小鼠增长体重的比较(n=10,g)Table 3 Comparison of weight gain among all groups

2.4 胃组织病理学观察

如图1 各组小鼠胃组织粘膜层、粘膜下层、肌层及浆膜层结构清晰,均未见明显的病理学改变,符合功能性消化不良动物模型的要求。

图1 胃组织病理学观察Note. A, Normal group. B, Model group. C, Low-dose Shenqu Xiaoshi oral liquid group. D, Medium-dose Shenqu Xiaoshi oral liquid group. E, High-dose Shenqu Xiaoshi oral liquid group.Figure 1 Pathological observation of gastric tissues

2.5 小鼠胃排空及肠推进功能

与正常组相比,模型组小鼠胃排空率和小肠推进率明显降低(P<0.05);与模型组相比,神曲消食口服液低、中及高剂量组胃排空率和小肠推进率明显升高(P<0.05),提示神曲消食口服液给药可促进小鼠胃排空和小肠推进功能,见表4。

表4 各组小鼠胃排空及肠推进功能的比较(n=10,%)Table 4 Comparison of gastric emptying and intestinal propulsion function among all groups

2.6 胃组织IREl 和TRAF2 表达情况

与正常组相比,模型组IREl 和TRAF2 mRNA和蛋白的表达明显上升(P<0.05);与模型组相比,神曲消食口服液低、中及高剂量组IREl 和TRAF2 mRNA 和蛋白的表达明显下降(P<0.05),提示神曲消食口服液给药可抑制小鼠IREl、TRAF2 mRNA 和蛋白的表达,从而改善内质网应激,见图2、表5。

表5 各组小鼠胃组织IREl 和TRAF2 表达的比较(n=10)Table 5 Comparison on the expression of IRE1 and TRAF2 proteins in gastric tissues among all groups

图2 各组小鼠胃组织IREl 和TRAF2 蛋白表达情况Note. A, Normal group. B, Model group. C, Low-dose Shenqu Xiaoshi oral liquid group. D, Medium-dose Shenqu Xiaoshi oral liquid group. E,High-dose Shenqu Xiaoshi oral liquid group.Figure 2 Expression of IRE1 and TRAF2 proteins in gastric tissues of each group

3 讨论

中医学中无“消化不良”的概念,结合临床表现,可归于“痞满”的范畴,因其“脾常不足”的生理特点,多表现为脾胃虚弱证[7]。 而神曲消食口服液具有健胃消食、健脾理气的功效,其主要药物有焦山楂、焦神曲、焦麦芽、党参、白术、茯苓、白芍、木香、醋延胡索、砂仁、甘草。 方中焦山楂、焦神曲、焦麦芽可消食导滞,党参、白术、茯苓、白芍可健脾益气,木香、醋延胡索、砂仁可健胃止痛,甘草则起调和诸药之效[8]。 临床研究结果显示,神曲消食口服液具有提高机体细胞免疫功能的作用,可上调血清HGB[9]。 但本研究结果显示,神曲消食口服液对RBC 及HGB 水平无明显影响,可能原因有:(1)KM 小鼠体内环境与人体具有差异性;(2)作用时间较短。

肝是人体酶含量最丰富的器官,当肝受到损伤,组织细胞内酶类会进入外周血液中,导致血清中酶活性的异常升高,常用于肝功能检查的指标主要有 ALT、AST 和 TBA 等[10]。 肾是重要的排泄器官,能调节机体内水电平衡、酸碱平衡。 BUN、CREA是临床常见的肾功能检测指标,在一定程度上可反映肾小球滤过功能[11]。 本研究结果显示,神曲消食口服液对正常小鼠上述肝肾功能指标均无明显影响,提示神曲消食口服液安全性较高。

本研究结果显示,与正常组比较,模型组大鼠的胃排空率和小肠推进率明显降低,说明建模后小鼠出现明显胃肠动力障碍,且小鼠胃组织未出现明显病理改变,但伴有体重降低、活跃度降低及情绪暴躁易怒,提示FD 造模成功。 经神曲消食口服液处理后,FD 小鼠体重增长加快,胃排空率和小肠推进率明显升高,提示神曲消食口服液可明显改善FD小鼠胃肠运动能力,与文献报道相符[12]。 近年来研究发现,内质网应激在FD 中有重要的作用[13]。 机体产生内质网应激后,引起IREl 与GRP78 的分离,激活 IREl 的核酸内切酶活性,招募接头分子TRAF2,引起细胞自噬或凋亡等其他变化,最终导致FD[14-15]。 本研究显示,与正常组比较,模型组胃组织中IREl 和TRAF2 mRNA 和蛋白的表达明显上调,说明FD 小鼠IREl 信号通路异常激活;但经神曲消食口服液处理后,IREl 和TRAF2 mRNA 和蛋白的表达明显下调,提示神曲消食口服液可能通过抑制IREl 和TRAF2 表达,改善内质网应激,从而提高胃肠道细胞活力,最终起到治疗FD 的作用。

综上所述,神曲消食口服液具有较好的安全性,且对FD 小鼠的胃肠运动有明显促进作用,可能与下调内质网因子IREl 和TRAF2 的表达,改善内质网应激有关。 同时在神曲消食口服液低、中、高剂量三组中,高剂量作用效果最强,提示中药在用量上亦存在量效关系,但仍需要采用不同的建模方法,选用不同的动物载体,作进一步验证。