丝胶蛋白精制纯化后用作牛血浆纤连蛋白冻干保护剂的试验

王志强 张慧华

(1.南阳市经济作物技术推广站，河南南阳 473000；2.河南民兴生物科技股份有限公司，河南社旗 473300)

纤连蛋白(fibronectin，FN)是一种多功能的细胞外基质糖蛋白，由两个几乎相同的分子量为220 kD的二硫键结合多肽组成[1]。细胞纤连蛋白在结构上和抗原性上类似于来自血浆的冷不溶性球蛋白，因此形成的多克隆抗体通常交叉反应[2]。FN分子含有几个功能和结构上不同的结构域，它们可以结合细胞表面受体，结合胶原蛋白、纤维蛋白原或纤维蛋白以及糖胺聚糖、蛋白多糖和肝素等[3]。因FN在液体状态下极易降解，致使其生物活性下降，所以将FN制备成冻干制剂是目前最常见的保存形式[4]。目前FN制剂中的保护剂为1%～2%的血清白蛋白和2%～3%的明胶等高分子聚合物。然而，由于血清白蛋白潜在的血源性病原体污染限制了其在蛋白产品中的应用，另外明胶受限于其浓度，浓度过大时会增加最终制剂的水分[5]。

丝胶是被覆于丝素外层的一种球状蛋白，约占蚕丝的20%～30%，其分子量在1.0～200 kD不等，含丝氨酸、天门冬氨酸、丙氨酸、谷氨酸、甘氨酸、苏氨酸、赖氨酸、精氨酸等18种氨基酸，其中包括人体所必需的八种氨基酸；丝胶蛋白中丝氨酸和天门冬氨酸等极性侧基氨基酸极高，是一种亲水基团极丰富的蛋白质，具有良好的水溶性和抗氧化性强[6]等特性。丝胶蛋白现已作为细胞培养的基质和促进细胞有丝分裂和增殖的添加物[7]， Kazuhisa等[8]发现丝胶蛋白对细胞和蛋白质有冻结保护作用，其抗冻保护作用与常见的抗冻保护剂牛血清白蛋白(BSA) 相当[9-11]。本试验将丝胶蛋白精制纯化后用作牛血浆FN的冻干保护剂，显现出良好的效果。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试材料

丝胶蛋白粉，分子量为8～30 kD， 河南民兴生物科技股份有限公司丝胶提取设备生产，蛋白质含量87.3%(纯度87.3%)，具体生产方法参见文献[12]；成年牛血浆，购自郑州九龙生物科技有限公司。

1.1.2 主要试剂

明胶-琼脂糖凝胶 Gelatin Sepharose 4B(以下简称明胶亲和介质),美国GE公司产品；间充质干细胞(MSC 细胞)，有北京科霖恩生物科技有限公司郭子宽教授赠送；乳糖、甘露醇、碳酸钠、柠檬酸三钠、右旋糖苷40、浓盐酸、尿素、精氨酸、丙烯酰胺、N，N'-亚甲基双丙烯酰胺，国药试剂，均为分析纯；BCA蛋白质定量试剂盒，天根生化科技(北京)有限公司；氯化钠、葡聚糖凝胶G-25，三羟甲基氨基甲烷、5×蛋白上样缓冲液(含DTT)、四甲基乙二胺、过硫酸铵、甲醇、硫酸铵、冰醋酸、彩虹180 光谱marker ( M )11～180 kD 、10×电泳转移缓冲液、十二烷基硫酸钠(Tris)、甘氨酸、考马斯亮蓝 G-250，北京索莱宝有限公司，均为分析纯；木瓜蛋白酶、聚乙二醇4000、明胶、重组人FN冻干粉、牛血清白蛋白(BSA)、纤维素酶、DMEM培养基，美国-Sigma-公司，均为细胞级。

1.1.3 主要仪器

LPG-5型高速离心喷雾干燥机，购自常州市升溢干燥设备有限公司；LGJ-50E 型真空冷冻干燥机，购自四环福瑞科仪科技发展(北京)有限公司 ；层析柱、恒温水浴锅、层析柜、PHS-3E型pH计、超纯水机，购自浙江力辰仪器科技有限公司；即用型透析袋(截留分子量3.5 kD、10.0 kD)、变性蛋白电泳预制胶(8%),购自北京索莱宝科技有限公司；凯式定氮仪，购自上海精密科学仪器有限公司；DYY-300型电泳仪，购自美国Bio-Rad公司；超净工作台、酶标仪、电动移液器，购自美国Thermo公司；电子天平，精度 0.001 g，购自上海恒平科学仪器有限公司；磁力搅拌器，购自常州市金坛大地自动化仪器厂； 96孔细胞培养板、150 mm细胞养皿、50 mL离心管、移液管，美国Corning公司产品。

1.2 试验方法

1.2.1 丝胶蛋白精制纯化

水解丝胶蛋白：称取20.0 g丝胶蛋白粉和8.0 g木瓜蛋白酶于烧杯中 ,加入pH为8.0的Tris-HCl缓冲液中，在42 ℃下水浴2 h后，然后再加入8.0 g木瓜蛋白酶继续水浴，2 h后，再次加入木瓜蛋白酶16.0 g，继续水浴2 h，停止水解，将水浴锅温度调节至65 ℃ 并保持30 min以灭活过量的木瓜蛋白酶，留样并做电泳分析。选择截留分子量为10 kD的透析袋，将上述经木瓜蛋白酶水解的丝胶溶液透析，得到透析液1。去除丝胶蛋白中的碳水化合物：称取6.0 g的纤维素酶于10 mL纯化水中，即配定出体积百分比浓度为60 % 的纤维素酶溶液，将透析液1与纤维素酶溶液按3∶1的比例混合，在40 ℃下水浴4 h后，将水浴锅调节至升65 ℃保持30 min以灭活过量的纤维素酶，选择截留分子量为3.5 kD的透析袋，将上述经纤维素酶水解的丝胶溶液透析，得到透析液2。浓缩干燥：将透析液2经高速离心喷雾干燥机浓缩干燥，即得到了精制丝胶蛋白粉，用凯式定氮仪检测精制丝胶蛋白粉的总氮含量，计算蛋白质含量。SDS-PAGE 法测其分子量。

1.2.2 FN分离

采用亲和层析的方法分离纯化FN。具体过程如下：将明胶亲和介质填充至层析柱中，并用Tris-柠檬酸钠缓冲液衡平衡明胶亲合介质；取解冻的成年牛血浆100 mL，8500 r/min，离心10 min，弃沉淀，收集上清液,并在37 ℃下复温30 min备用；稀释上述血浆至500 mL，上柱亲和，置层析柜中(7 ℃)，控制流速恒定在75～90 mL/h；洗涤杂蛋白，将明胶亲和介质用1 500 mL的 Tris-柠檬酸钠平衡液洗涤3～5次，最后用含1 M的 NaCl的Tris-柠檬酸钠缓冲液流洗明胶亲和介质1～2次；解离目标蛋白，用含4 M尿素的Tris-柠檬酸钠缓冲液洗涤明胶亲和介质2～3次，收集洗涤液，即得到含有目标蛋白FN的溶液；浓缩除盐，通过葡聚糖凝胶G-25介质，用20 mmol的柠檬酸缓冲液对上述含FN的溶液层析除盐，通过紫外吸收仪检测并收集层析流出液。采用SDS-PAGE 法检测其分子量。

1.2.3 保护剂筛选

设计4组蛋白保护剂处方分别加入经浓缩除盐后的FN溶液中, 冷冻干燥后观察外观进行筛选, 具体分组见表1。

表1 试验分组

1.2.4 长期稳定性实验

降解是蛋白质不稳定的明显表现，因FN分子量较大，为45 000 kD，极易降解。 因此将1.2.3 中的4组冻干FN制剂在室温进行长期稳定性试验。上述在室温下分别保存6个月、12个月和30 个月后，用SDS-PAGE 法测定冻干FN制剂分子量，观察是否降解。

1.2.5 FN冻干制剂活性检测

将冻干的FN加入注射用水溶解,调整浓度向96孔细胞培养板各孔中加入100 μL体积质量浓度为5μg/mL的FN蛋白溶液, 室温下孵育3 h, 没有吸附的FN 以PBS冲洗3次, 包被完成后。MSC细胞悬浮于DMEM 培养液中, 调整其浓度，使浓度大约在105 cells/mL。向孔中加入100 μL的细胞悬浮液,并用PBS做空白对照试验， 37 ℃下孵育30 min, PBS洗涤未被吸附的细胞, 并在显微镜下观察细胞贴壁现象。

2 结果与分析

2.1 精制纯化的丝胶蛋白分子量确定及蛋白质含量测定

试验选用木瓜蛋白酶水解丝胶蛋白粉。木瓜蛋白酶作用温和，对蛋白质损伤较小，属巯基蛋白酶，作用于蛋白质中L-精氨酸、L-赖氨酸、甘氨酸和L-瓜氨酸残基羧基参与形成的肽链，属于内切酶，能切开全蛋白质分子内部肽链CO-NH，生成分子量较小的多肽类。水解后透析，再经纤维素酶水解去除碳水化合物，透析，最后经高速离心喷雾干燥制得精制纯化的丝胶蛋白粉。SDS-PAGE测其分子量，结果如图1所示，精制纯化后的丝胶蛋白分子量集中分布在14.4 kD。

M—蛋白标准品 marker(范围：14.4～97.4 kD)

M—蛋白标准品 marker(范围：11～180 kD)

M—蛋白标准品 marker(范围：11～180 kD)

用凯式定氮仪测得精制丝胶蛋白粉的总氮含量为15.278%，计算得出蛋白质含量为98.3%(氮转换系数6.25)。

2.2 分离纯化的FN分子量确定

基于FN与变性胶原蛋白(通常为明胶)的高特异亲和性的结合，试验通过明胶亲和介质从牛血浆中分离出含FN溶液，再经G-25除盐，制备FN。SDS-PAGE 法检测其分子量，从图2可以看出FN单链分子量为220 kD。通常FN 以分子量为450 kD左右的二聚体形式存在, 单体分子量为220～250 kD, 由位于蛋白质羧基端的二硫键相连。

2.3 FN冻干制剂长期稳定试验

设计4组蛋白保护剂配方分别加入经浓缩除盐后的FN溶液中, 冷冻干燥，制备冻干粉，在室温下保存30个月，SDS-PAGE 法检测其是否降解。结果如图3所示。结果显示FN冻干制剂在配方Ⅰ和Ⅱ下，保存30个月不降解，在配方Ⅲ和Ⅳ下，保存30个月后明显出现降解。结果说明含丝胶蛋白的FN冻干制剂稳定性可与常规保护剂血清白蛋白相媲美。

2.4 FN冻干制剂活性检测

与FN直接作用的氨基酸序列为Arg -Gly -Asp-Ser, 当FN以不可溶形态固定于培养板表面时, 这些序列就可以促进细胞的贴壁, 因此在细胞培养中FN具有促进细胞相互作用、有利于细胞贴壁及平铺的生物功能[12-13，20]。利用该原理做活性检测试验，结果显示：从MSC细胞培养检测牛血浆中FN活性实验中可以观察到, 加有FN冻干制剂和加有FN标准品(重组人FN 样品)的组织培养孔中均有大量的细胞贴壁, 而空白孔中细胞却没有贴壁。由此可以说明采Gelatin-Sepharose 4B分离纯化方法得到的牛血浆FN，再引入丝胶蛋白做为FN的冻干保护剂，检测其生物活性，结果表明其与人FN具有相同的生物活性。

3 小结与讨论

FN是一种分布很广泛的高分子量糖蛋白, 存在于血浆、细胞胞内及不同细胞表面中, 通常以分子量为450 kD 左右的二聚体形式存在, 单体分子量为220 kD左右, 由位于蛋白质羧基端的二硫键相连。其具有与细胞外基质如胶原、血纤蛋白、肝素等物质的结合位点, 因此在很多重要的生理过程如伤口愈合、止血和凝血中都发挥着重要的作用。FN常制备为冻干粉保存，本文在FN冻干制剂中引入经精制纯化的丝胶蛋白做为其冻干保护剂，表现出与血清白蛋白相同的效果， FN冻干制剂在配方Ⅰ(2%丝胶蛋白+1%甘露醇)和Ⅱ(1%丝胶蛋白+1%PEG 4000+1%甘露醇)下，保存30个月不降解，活性检测结果显示FN冻干制剂生物活性可与重组人FN相媲美。

丝胶蛋白作为一种含有18种氨基酸的球状蛋白质，其作为促进细胞生长、组织再生[24]等的载体并完成了组织再生的目的后，还能被人体组织所吸收，进入人体循环代谢，提供康复营养[25]。基于众多优势，丝胶蛋白作为组织工程支架的研究备受关注，正逐渐成为生物医学领域最有前景的生物材料之一[18]。本文以经精制纯化的丝胶蛋白作为FN冻干制剂的保护剂，实验结果表明：丝胶蛋白对蛋白质有冻结保护作用，其抗冻保护作用与常见的抗冻保护剂牛血清白蛋白(BSA) 相当。