凝集素亲和层析技术分离金花茶多糖的研究

路垚+林华娟+杨基住

摘 要：以蓖麻凝集素（RCA）为亲和配体制备亲和层析树脂，在比较2种固定载体制备亲和树脂对金花茶多糖分离效果的基础上，探讨了多糖上样量、NaCl浓度以及洗涤量对RCA-Sepharose-2B亲和树脂结合率或再生效果的影响，并采用高效液相色谱（HPLC）对亲和多糖进行分离效果分析，为将亲和层析技术应用于金花茶活性多糖的分离纯化提供科学依据。研究结果显示，相比AF-Amino-650 m树脂，RCA-Sepharose 2B亲和树脂的分离效果比较好，而且可以进行反复使用多次。多糖上样量显著影响多糖与树脂的亲和效果，多糖结合率随上样量增加呈倒U型变化，当多糖上样量为10.4 mg/g亲和层析树脂时，其亲合率最高，达到57 %左右；NaCl浓度对树脂的再生效果也有显著影响，用含0.2 mol/L NaCl的磷酸缓冲液洗涤树脂可以有效恢复树脂对多糖的亲和效果。HPLC分析结果显示分离获得的亲和活性多糖是由3种不同分子量的多糖组分组成。

关键词：金花茶 多糖 蓖麻凝集素 亲和层析 分子量

金花茶（Camellia chrysantha（Hu）Tuyama）为山茶科、山茶属、金花茶组植物，常绿灌木或小乔木；仅分布于我国广西及越南北部。因其特有的金黄花色和生理活性功能，被称为“茶族皇后”、“植物界的大熊猫”。现代研究表明，金花茶具有抗氧化[1-5 ]、抑制肿瘤生长[6-8 ]、降血脂[9-10 ]等生理活性，其中多糖被认为是重要的生理活性成分之一，但其构效关系尚不清楚。动物试验研究结果显示，金花茶粗多糖具有明显的降血脂作用[10 ]。田晓春等[11 ]采用离子交换柱层析对金花茶多糖进行分离纯化得到TPS0、TPS1、TPS2、TPS3、TPS4、TPS5 6个组分，随后林华娟等[12 ]进一步采用凝胶柱层析对TPS3组分进行分离纯化，又将其分为2个多糖组分，并对其进行了化学结构特征分析。这些研究结果表明，金花茶多糖组成相当复杂。由于所用的离子交换柱层析和凝胶柱层析等传统分离纯化方法效率低、损失大，通过这些方法仅能获得少量纯化多糖用于化学结构分析，不能满足其功能研究需求。因此有必要探索采用其他分离技术进行金花茶多糖的分离纯化。在前期研究中，路垚等[13 ]探讨了金花茶多糖与伴刀豆凝集素、蓖麻凝集素、欧卫矛凝集素等的凝集反应特性，结果表明金花茶多糖与凝集素有明显的凝集反应特征，推测能与凝集素发生凝集反应的多糖很可能就是活性多糖，但是与不同凝集素其凝集反应强度有明显的差异，其中与蓖麻凝集素的凝集反应为最强。因此本研究尝试以蓖麻凝集素为亲和配体，制备亲和层析树脂，探讨将亲和层析技术应用于金花茶活性多糖的分离纯化，为金花茶活性多糖的高效分离纯化提供理论依据。

1 实验材料与仪器

1.1 实验原料

金花茶叶片于2012年3月采摘于广西防城港市十万大山金花茶基地，采摘后立即微波烘干，送至广西桂人堂金花茶股份有限公司实验室，粉碎分装，于-20 ℃下保存备用。

亲和层析基质AF-Amino-650 m，TOSOH公司（日本）；亲和层析基质Sepharose-2B，上海莱宝生物科技有限公司；蓖麻凝集素（RCA），Vector公司（美国）。

1.2 实验仪器

LC-20AT高效液相色谱仪，日本岛津公司；Sugar KS-804分析色谱柱，昭和通商株式会社。

2 实验方法

2.1 一般化学测定方法

蛋白质含量的测定采用考马斯亮蓝法进行[14 ]。

总糖含量的测定采用苯酚硫酸法进行[15 ]。

2.2 金花茶多糖的制备

金花茶多糖的制备。称取 10 g金花茶叶粉末，加入10倍量蒸馏水，在 121 ℃条件下提取30 min，冷却后先用纱布过滤，过滤液再通过离心（1.8 ×104 r/min，15 min）去除残渣，得到提取上清液。残渣用同样方法反复提取 2 次，将得到的提取上清液混合均匀。提取液再经过乙醇沉淀得到沉淀多糖。沉淀多糖用少量水溶解后经过充分透析（截留分子量 12 ku），冷冻干燥后得到金花茶多糖。

2.3 RCA-Amino凝集素亲和层析树脂的制备

取5 mL AF-Amino-650 m，用0.1 mol/L的 NaHCO3 缓冲液（pH 9.0）反复抽滤清洗，转入10 mL 40 %的乙二胺溶液（pH 10.0）中，4 ℃下温和搅拌6 h，置于4 ℃冰箱下过夜，砂芯漏斗过滤，加入10 mL 含0.2 m乙二醇的0.1 mol/L NaHCO3缓冲液（pH 9.0），室温下温和搅拌2 h，抽滤，用0.1 mol/L的NaHCO3 缓冲液（pH9.0）充分洗涤，去除乙二醇，加入10 mL含1 %戊二醛的0.1 mol/L NaHCO3缓冲液（pH9.0），室温下温和搅拌10 min，抽滤，用0.1 mol/L的 NaHCO3 缓冲液（pH 9.0）充分洗涤，去除戊二醛，加入2 mL含5 mg/mL蓖麻凝集素（RCA）和75 mg/mL半乳糖的0.1 mol/L NaHCO3 缓冲液（pH 9.0），室温下温和搅拌30 min，抽滤，加入10 mL 含0.2 mol/L甘氨酸的0.1 mol/L NaHCO3 缓冲液（pH 9.0），室温下温和搅拌1 h，抽滤，用超纯水，2 mol/L 的 NaCl溶液，超纯水，0.1 mol/L 醋酸钠缓冲液（pH 4.5），超纯水依次洗涤，最后用50 mmol/L的磷酸缓冲液（pH 7.4）充分洗涤，即得到RCA-Amino亲和层析树脂，加入防腐剂，冰箱内保存待用[16 ]。根据偶联前后凝集素（以蛋白质含量计）的变化计算偶联率。

2.4 RCA-Sepharose 2B凝集素亲和层析树脂的制备

Sepharose-2B的活化[16 ]：取5 mL的 Sepharose- 2B，放入砂芯漏斗中，用蒸馏水反复清洗3～5次，将Sepharose-2B悬液与2 mol/L Na2CO3溶液按体积比1：1 的比例混成悬浮液，缓慢搅拌，再加速搅拌，在通风橱中加5 mL浓度约为1 g/mL溴化氰的乙腈溶液，用6 mol/L的NaOH 溶液调pH至10.5 左右，稳定后计时15 min，迅速转移至砂芯漏斗内抽滤，用200 mL冰冷的浓度为0.1 mol/L NaHCO3 缓冲液（pH 9.0）进行冲洗，抽干成湿饼状，转移至pH 为10的40 %的乙二胺溶液中，冰浴下搅拌5 h，放入4 ℃冰箱过夜。