石蜡制片的方法、技巧与注意事项

何艳艳

摘 要：石蜡切片法是常规制片技术中应用最广泛的1种。在整个制片过程中，环节多而且相互影响、相互制约，每1个环节对总的制片质量都有极大的影响，所以，每1步必须严格操作。在此以朱槿的子房为例，将制片过程主要分为前、中、后3个工作时期，详细的介绍石蜡切片的方法、技巧与注意事项。同时在脱水与透明的过程用抽气泵抽气，此与常规方法不同，而且本文介绍的方法比较简单，主要为环境条件较差的石蜡制片提供实验参考。

关键词：石蜡切片 方法 技巧 注意事项

石蜡切片法是以石蜡作为包埋剂，用旋转切片机将材料切成薄片，经熬蜡、取材、固定、抽气、洗涤、脱水、透明、浸蜡、包埋、修块、切片、粘片、脱蜡、染色、封片等一系列处理制成永久制片的方法。在研究植物的细胞、组织、胚胎以及形态等方面石蜡切片法是最理想的制片方法。细胞和组织多为无色透明，离开机体后会很快发生溶解和腐败，细胞原始形态和结构难以保存[1 ]。通过石蜡切片制作技术，可以长期的保持其形态结构，进行观察研究。但缺点是石蜡切片制作过程复杂，制作周期长，组织块易破碎，切片皱褶多等[2 ]。所以，在每1步操作中都要严格、小心谨慎。通过长期的摸索，在实验条件稍差的情况下，总结出相应的方法技巧和注意事项，以此保证制片的成功性。

1 前期工作

1.1 材料准备

朱槿子房采自广西大学。实验仪器：电磁炉、抽气装置、恒温水浴锅、恒温箱、石蜡切片机、显微镜。实验试剂：无水乙醇、95 %乙醇、甲醛、冰醋酸、TO透明剂、石蜡熔点56 ℃～58 ℃（根据自己材料的硬度选择合适的熔点），中性树胶。

取材方法：

大面积的在朱槿开花的第1 d进行标记，每1 d采摘5个，直到采摘到不能采摘，如采摘第1 d到第16 d的朱槿子房，当有花瓣时，要去除所有的花瓣，拨到只剩子房。

注意事项：

①一般在晴天的早晨9：00～10：00时取材，此时植物细胞分裂活动较明显。

②取材后马上固定，以保证植物细胞自然状态，而不至于在细胞死亡之前材料的形态和结构发生变化。

1.2 固定材料

FAA固定液固定，甲醛：冰醋酸：70 %乙醇=5：5：90[3 ]，幼嫩材料用50 %乙醇，代替70 %乙醇，可防止材料收缩，还可以加入5 mL甘油（丙三醇）以防止蒸发和材料变硬。材料固定完毕，贴上标签。

注意事项：

①FAA固定液称为万能固定液，一般固定的时间不低于24 h。

②材料较大时，最好要切成3～5 mm长，还要切掉不需要的材料，这样既有利于固定又有利于其他溶液与石蜡的进入。

③固定液用量要达到材料体积的20～50倍，否则，材料中的水分稀释固定液的浓度，降低固定效果[3 ]。

④固定时要对材料进行真空抽气，组织、细胞中都有空气，会组织固定液渗透到组织中，使固定不全面不彻底，影响后续的浸蜡、切片等[3 ]。抽气最好用抽气泵抽气20～30 min，用小药瓶装时，简易的可用注射器抽气。

1.3 熬制石蜡

用70 ℃左右温度的电磁炉熬制石蜡，只要一冒烟就关闭，在恒温箱中过滤，然后将石蜡用烧杯装置放在70 ℃的水浴锅中熬制，7 d左右，也可能更多天，具体要看石蜡的质量，其实熬制石蜡的时间在多不在少，越熬制越好用。若是有必要过滤就再过滤1次。

注意事项：

①在此过程中要切记每天去看看水浴锅是否要加水，不能让水干掉，以免出现事故。

②不能让水进入石蜡中，若有少量水进入可用加热的滴管吸出，若有大量水进入只要将上层石蜡倒入到另1个烧杯即可。

③使用之前可以用切片机试试石蜡是否能切出完好无缺的石蜡片，若不能就必须继续熬制。

④石蜡在使用过程中，可以重复使用，如浸蜡时的石蜡可收集与下次再使用，包埋用过的石蜡可过滤后再次使用。

2 中期工作

2.1 脱水

先用与固定液同浓度的酒精清洗，再用70 %、75 %、80 %、85 %、90 %、95 %乙醇溶液，到无水酒精2次（2次无水酒精脱水是为了更彻底），每1级用抽气装置抽气20 min，静止20 min。此过程的作用是让1种既溶于水又溶于TO的酒精把固定液彻底替换出来，并使材料中的水分逐步（逐级）被吸出来。TO不溶于水，所以材料中的水必须完全被酒精取代，TO才能完全渗透到细胞中。

注意事项：

①在整个过程中，使用指形管比较方便，同时节约溶液。

②在更换高1级的脱水剂时，最好不要移动材料，以免损坏材料。

③高浓度酒精对组织有强烈收缩及脆化缺点，因此用酒精脱水不能直接入纯酒精中脱水，而必须经过由高到低一系列不同浓度的酒精，逐渐取代组织中水分，以保证脱水彻底，并避免组织过度收缩和硬化。

2.2 透明

2/3无水乙醇+1/3TO、1/2无水乙醇+1/2TO、1/3无水乙醇+2/3 TO，TO 2次（2次TO透明是为了更彻底），每1级抽气20 min，静置20 min。由于TO溶剂能使材料透明，因此这个过程称为“透明”。为了避免材料收缩，采取逐步从酒精中过渡到TO中。

2.3 浸蜡

将材料用少量TO与石蜡放在电热恒温水浴锅中56 ℃过夜（我用的是熔点56 ℃～58 ℃石蜡），6～7 d，可打开盖，让TO慢慢蒸发，然后，将电热恒温水浴锅升至58 ℃用包埋所用的纯蜡，每1 d换1次，共处理2～3次。最好是借助弄几个与指形管差不多大小洞的泡沫板，放在电热恒温水浴锅上，然后把指形管插进烧杯上面的泡沫板，这样是为了避免有水进去。此过程目的要从低温到高温，从低浓度到高浓度，使石蜡慢慢渗人到组织中，将石蜡完全代替材料中的透明剂，这样切片时材料才不会切坏。切记要回收废蜡，并标明清楚，以利于下次使用。endprint

注意事项：

①第1步到第3步必须连续完成。

②在这3步中，溶液最好稍多于指形管1/3的容积，否则会脱水、透明、浸蜡不彻底，造成实验失败，太多则可能因抽气而溢出。

③在浸蜡的过程中，千万不能有水进入到指形管中，否则将不能切片成功。

2.4 包埋

先将材料从指形管倒入用电磁炉水浴的小烧饼中，把溶解的石蜡转入包埋盒内，马上用热镊子夹取材料放入盒内彼此间留一定距离并整齐排放，待到盒内蜡面渐呈薄膜凝固，面平放与水中浸没后翻转盒底向上，将己冷却凝固的蜡块捞出盒底向上晾干，也可以使它自然冷却。

注意事项：根据材料大小，确定所需纸盒的尺寸，用表面光滑的牛皮纸预先叠好。

2.5 切片

用粘有TO的药棉擦洗切片的刀，固定好，调到你要切片的厚度（我主要切10 μm厚），然后把蜡块切成小块粘在小木块上，用粘有石蜡的玻璃棒在酒精灯上加热，粘在小蜡块与小木块的边界处，使小蜡块与小木块固定好，便可以切片。

2.6 贴片

用玻璃棒粘少量的鸡蛋清轻轻点一点在载玻片上，然后用手涂抹均匀，再加较多的蒸馏水，选一些较好的切片整齐地贴在载玻片上，此时是切片漂浮在水面上。

鸡蛋清制取：在鸡蛋上开1个小孔，让蛋清流入瓶中，蛋黄完全在蛋壳内，最好是放置在冰箱中保存。

注意事项：在切片与贴片过程中，使用毛笔更加方便。

2.7 展片

将贴好片的载玻片快速地放在酒精灯加热，蜡片受热后会慢慢伸平，然后用吸水纸吸走多余的水分，让石蜡片紧紧的贴在载玻片上。

注意事项：把贴好片的载玻片地放在酒精灯加热时，要控制好时间，最好是快速地加热一会，然后移开观察，气温的差异直接影响时间的多少。

2.8 染色

石蜡切片经TO（5～10 min直到TO完全溶化）、第2次TO（时间自定）、1/2+1/2（10～30 s）、100 %（10～30 s）、95 %（10～30 s）、85 %（10～30 s）、70 %（10～30 s）、50 %（10～30 s）各级酒精溶液、蒸馏水（10～30 s）、1 %番红溶液中染色约（1～2 h），蒸馏水（2 min）、50 %（10～30 s）、70 %（10～30 s）、85 %（10～30 s）、95 %（10～30 s）各级酒精溶液、0. 2 %固绿（2 min）、95 %（10～30 s）酒精、100 %（10～30 s）酒精、1/2无水酒精+1/2TO（10～30 s）、TO（10～30 s）。由于染色剂中有大量的水，所以脱蜡后的无水材料必须从高浓度的酒精开始，逐级进入低浓度的酒精溶液，最后一级通常的50 %酒精，使材料中的水分逐渐增加，这个过程称为复水。如果不经过复水，材料脱蜡后直接进入染色剂中，材料将会严重变形，甚至难以染色。

注意事项：

①上面的时间大多是根据具体的实验有所更改。

②染色的方法有许多，番红——固绿法是比较常用的一种。

③使用染色的玻璃杯，更方便。

3 后期工作

封片

在载玻片上放上中性树胶，从侧面慢慢移动盖上盖玻片，在恒温箱中32 ℃烘干或置于室内自然晾干[4 ]。

注意事项：

①玻片中不能有气泡存在，若有，可将载玻片置于酒精灯上来回摆动，以除去气泡。

②玻片不能在日光下晒干，以免退色。

4 实验分析

制作的朱槿子房的石蜡切片在光学显微镜下观察，结构清晰。此石蜡切片的方法，在脱水与透明的过程明显与一般的石蜡切片的方法有所不同，主要采取抽气泵抽气的方法来缩短实验时间，否则1 d之内很难连续做完脱水与透明，同时因为此措施增加了实验的成功率。此外在许多细节上提出了注意事项与操作技巧，在石蜡切片中，制作程序繁多，每1步操作对最后制片效果都有极大影响，所以细节是决定成败的重要因素，因此实验时要严格、认真、细致操作，才能得出完好的切片和清晰的观察。

参考文献

[1] Wang Jinping，Zhang Junmei. Manufaction of paraffin section on Chinese pulsatilla flower[J]. Journal of Xinyang Normal University：Natural Science Edition，2008，21（4）： 573-576.

[2] 付霞，刘金华，梁秀就. 大鼠眼球标本石蜡切片的改良制作方法[J]. 眼科新进展，2007，27（6）：417-419.

[3] 段国禄，施江，等. 植物制片、标本制作和植物鉴定[M]. 北京：气象出版社，2008.

[4] 张宝华. 聚焦植物石蜡切片制作[J]. 吉林省教育学院学报，2013，29（4）：153-154.endprint