小檗碱对心肌纤维化心房重构影响及机制研究

王 洋，张 建，杨忠路，兰 怀，王辉山

1.辽宁中医药大学，辽宁 沈阳 110847；2.北部战区总医院 心血管外科，辽宁 沈阳 110016

心房颤动的病理生理机制高度复杂且多变，不同的危险因素在特定的个体中促发不良的心房重构过程，从而导致心房颤动[1-2]。心房颤动的维持与心房重构密切相关，心房重构包括电重构与结构重构，共同构成心房颤动发生与持续的病理基础。心房增大及心肌纤维化被认为是心房颤动相关结构重构的标志[3-4]。心房颤动可促进心房纤维化[5-7]。因此，防止心肌纤维化的形成对心房颤动的治疗具有重要意义。有研究表明，小檗碱是治疗心血管疾病最有前途的天然产物衍生药物之一，可通过激活触发各种信号通路以防治心血管疾病[7-10]。既往研究发现，小檗碱可抑制心肌纤维化的发展[11-12]。本研究通过建立心房纤维化模型，探讨小檗碱对心肌纤维化心房重构的影响及机制。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物及试剂 选取30只普通级健康雄性新西兰大耳白兔为研究对象，体质量2.8～3.2 kg，购自青岛康大生物科技有限公司。盐酸小檗碱(东北制药集团沈阳第一制药有限公司)；免疫组化试剂盒(江苏凯基生物技术股份有限公司)；α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)抗体(Immunoway YM3365)；Masson三色染色液(珠海贝索生物技术有限公司)；苏木素-伊红(hematoxylin-eosin staining，HE)染液(江苏凯基生物技术股份有限公司)；2.4 GHz科研型植入式动物遥测刺激系统、植入子(型号：Ensense-2.4G)、六通道接收机系统(型号：Ensense-2.4G)。本研究对白兔的处置符合动物伦理学标准。

1.2 分组及模型制备 采用随机数字表法将其分为左心房快速起搏组(RAP组)、左心房快速起搏+小檗碱组(RAP+BBR组)、假手术组(SHAM组)、假手术+小檗碱组(SHAM+BBR组)、空白对照组(Control组)，每组各6只。RAP+BBR组及SHAM+BBR组术前给予小檗碱100 mg/(kg·d)灌胃，1次/d，持续1周。RAP组、SHAM组、Control组均给予等量生理盐水灌胃，1次/d，持续1周。术后给予发放间歇电刺激。具体参数设定为：刺激2 s暂停2 s、频率20 Hz、强度2 mA、脉宽1 ms。按此程序刺激2周。同时RAP+BBR组及SHAM+BBR组给予小檗碱灌胃(同术前)，持续2周。RAP组、SHAM组、Control组均给予等量生理盐水灌胃(同术前)。给予兔陆眠宁Ⅱ和咪达唑仑麻醉后，剪开左侧中上腹部皮肤至皮下层，制作皮下囊袋置入植入子，4根电极导线经皮下隧道延伸，在两侧腋下皮下缝置两个心电采集电极，观察心电图。经三肋间开胸，剪开心包，两个刺激电极分别缝合于左心耳和左心房上，两个电极间至少保持10 mm距离，缝合切口。应用青霉素钠抗感染。实验兔恢复后，开启动物遥测刺激系统，通过无线收发采集和刺激信号，利用PowerLab生理记录仪连续监测体表I导联心电信号，通过专用计算机程序刺激软件，发放间歇电刺激。各组实验兔均在术后2周处死，摘取整个左心房组织，称重，部分心房心肌应用4%多聚甲醛浸泡固定，后期脱水包埋蜡块。部分液氮速冻后置于-80℃的冰箱中保存备用。

1.3 组织学分析 切取4～5 μm的石蜡切片，进行Masson染色及胶原容量分数(collagen volume fraction，CVF)计算，评估纤维化面积。测量蓝色区域显示纤维化，红色标记心肌细胞。另取4～5 μm切片进行HE染色，评估心肌细胞的胶原纤维变化。

1.4 免疫组织化学测定 心房组织标本切成4～5 μm切片，在二甲苯和乙醇中脱蜡至水，抗体在4℃过夜。磷酸缓冲盐溶液处理后，滴加羊抗兔二抗，二氨基联苯胺显色，苏木素复染，封片。

1.5 α-SMA表达的检测 将心房组织匀浆，离心。采用二喹啉甲酸蛋白测定试剂盒(上海铂莱生物科技有限公司)定量总蛋白。蛋白质在10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺变性凝胶上装载与分离，转移到聚偏二氟乙烯膜上。分别用β-actin(1∶1 000，Abcam)、α-SMA(1∶500，Immunoway)一抗在4℃过夜。经TBST洗涤后，加5%牛血清白蛋白稀释荧光二抗，室温下孵育1 h。采用全自动凝胶成像分析系统(上海天能科技有限公司)进行定量。

2 结果

2.1 小檗碱对各组实验兔左房质量的影响 RAP组左房质量显著高于其他各组，差异有统计学意义(P<0.05)；SHAM+BBR组左房质量高于Control组，差异有统计学意义(P<0.05)。见图1。

图1 小檗碱对各组实验兔左房质量影响

2.2 各组心房组织Masson染色及CVF定量分析 各组心房组织Masson染色结果见图2。胶原纤维呈蓝色，心肌细胞呈红色。RAP组心肌纤维化面积增多。RAP+BBR组心肌间质纤维化较RAP组明显减轻。SHAM组与SHAM+BBR组纤维化程度相当。Control组心肌纤维排列整齐，细胞核大小正常。CVF定量分析显示，与Control组比较，其他各组心肌间质纤维化明显增加(P<0.05)，RAP+BBR组胶原纤维数量较RAP组明显减少(P<0.05)，SHAM组与SHAM+BBR组胶原纤维数量相当(P>0.05)。见图3。

图2 各组心房组织标本Masson染色分析(HE×20)

图3 CVF定量分析染色结果

2.3 各组心房组织HE染色结果 Control组心肌纤维排列整齐致密，细胞核清晰，细胞外基质减少，而RAP组心肌纤维萎缩、排列紊乱，并有大量炎症细胞浸润。与RAP组比较，RAP+BBR组上述病理改变明显减轻。SHAM组与SHAM+BBR组病理改变程度相当，介于RAP+BBR组与Control组之间。见图4。

图4 各组心房组织HE染色结果(HE×20)

2.4 RAP组与RAP+BBR组心房组织中α-SMA表达情况 RAP+BBR组心房组织α-SMA表达明显低于RAP组，差异有统计学意义(P<0.05)。见图5～6。

图5 RAP组与RAP+BBR组心房组织中α-SMA与β-actin蛋白印迹图

3 讨论

心房重构，特别是间质纤维化，是心房颤动发生的重要因素[13]。心房重构包括电重构与结构重构，心房纤维化是心房颤动主要病理改变之一。心房增大和心肌纤维化是心房结构重构的主要特征[14]，该过程是不可逆的。心功能改变与心肌间质胶原过度沉积是心肌纤维化的特征，心房组织中CVF为临床上心肌纤维化程度的指标[15]。成纤维细胞分化为肌成纤维细胞的标记物是α-SMA。α-SMA的表达对心房颤动产生了明显的影响，并且会引起心房结构重构[16]。

本研究发现，造模2周后，RAP组心房质量明显增大，RAP+BBR组心房重量较RAP组明显减小。Masson染色发现，RAP+BBR组心肌纤维化程度较RAP组明显减轻。以上结果提示，小檗碱能抑制RAP组心房纤维化。免疫组化结果显示，与RAP组比较，RAP+BBR组α-SMA阳性细胞数量显著减低，α-SMA表达水平受到抑制，说明小檗碱治疗改善了这一变化。本研究证实，单独的RAP可以引起胶原纤维在心房肌中的表达，提示心房颤动期间的心动过速可能引起心房纤维化导致的心房重构，同时伴有左房质量的增加。小檗碱可通过抑制a-SMA表达，有效抑制RAP诱导的心房纤维化和伴随的心房颤动易感性。

图6 半定量分析α-SMA表达

综上所述，小檗碱可能通过减轻心肌纤维化，进而产生预防心房颤动的作用，为心肌纤维化与心房颤动的治疗提供新的治疗靶点。