脂肪间充质干细胞移植对放射性碘131诱导后大鼠甲状腺功能减退影响

郝珊瑚，战 莹，王治国，武晓丹，张国旭

北部战区总医院 核医学科，辽宁 沈阳 110016

甲状腺功能减退是由于甲状腺激素合成及分泌减少导致的机体代谢降低的一种疾病，临床表现为皮肤干燥、脱发、便秘、易疲劳、睡眠障碍、抑郁等[1-2]，严重影响患者的生活质量。近年来，甲状腺切除术及放射性碘131(131Iodine,131I)治疗导致的永久性甲状腺功能减退不断增加，临床多采用甲状腺素替代治疗，而长期服用甲状腺素会影响部分患者的身心健康。脂肪间充质干细胞(adipose-derived stem cells，ADSCs)是从脂肪组织中分离出来的具有自我更新与多向分化潜能的多能干细胞。有研究表明，ADSCs可分泌多种生物活性因子，在组织损伤、修复方面具有重要作用[3]。本研究建立甲状腺功能减低症大鼠模型，旨在探讨ADSCs治疗甲状腺功能减退的可行性及有效性。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 40只6周龄雄性SD大鼠(购自辽宁长生生物技术股份有限公司)，体质量150～172 g。饲养于北部战区总医院动物实验科，饲养温度18℃～23℃，相对湿度40%～70%，自由饮水摄食。每周观察大鼠生存状态，包括毛发情况、精神状态、活动情况、饮食饮水情况等，测量并记录大鼠体质量变化。

1.2 模型构建及实验分组 40只大鼠随机分成4组：阴性对照组，腹腔注射0.5 ml生理盐水；131I模型组，腹腔注射250 μCi131I加入生理盐水至0.5 ml；药物对照组，在131I模型组基础上，每天给予左甲状腺素钠片水溶液0.5 ml进行灌胃治疗；ADSCs治疗组，在131I模型组基础上，4周后接受ADSCs移植。

1.3 干细胞的制备及移植 将人ADSCs细胞无菌条件下分离纯化获得脂肪组织，于37℃，5%CO2条件下，体外培养扩增4～7代细胞，经流式细胞术检测表面标记物，并进行细胞分化功能检测，最终确定为合格细胞制品。ADSCs治疗组尾静脉注射ADSCs混悬液0.1 ml(密度为1×106个/ml)。

1.4 甲状腺激素及炎性因子水平检测 收集眼眦静脉血1 ml，置聚丙烯EDTA抗凝管中，4℃下，以3 000 r/min离心10 min，取血清保存于-80℃冰箱中。采用酶联免疫吸附法检测血清中促甲状腺激素(thyroid stimulating hormone，TSH)、游离三碘甲状腺原氨酸(free triiodothyronine，FT3)、游离甲状腺素(free thyroxine，FT4)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor，TNF-α)、白细胞介素6(interleukin-6，IL-6)及白细胞介素10(interleukin-10，IL-10)水平。实验步骤严格均严格按照试剂盒说明书进行。吸光度值采用美国BIO-RAD伯乐550型酶标仪测量，波长为450 nm。

1.5 甲状腺131I静态显像 大鼠接受不同组内干预措施后，腹腔注射10%水合氯醛进行麻醉，仰卧位固定，充分显露颈部。分别向各组大鼠腹腔注入131I-碘化钠显像剂20 μCi，显像剂由中国工程物理研究院物理与化学研究所提供。注射24 h后，行甲状腺131I静态显像。甲状腺131I静态显像采用德国Siemens公司Symbia T16 SPECT/CT仪，采用高能平行孔准直器，采集矩阵128×128，每帧采集300 K计数。

2 结果

2.1 各组大鼠体质量变化比较 实验前，4组大鼠的体质量比较，差异无统计学意义(P>0.05)。阴性对照组大鼠在整个实验过程中体质量持续增长，其他3组大鼠注射131I后，体质量增加缓慢，131I模型组与药物对照组大鼠在第6周后，出现体质量下降趋势，而ADSCs治疗组大鼠在干细胞移植后，体质量逐渐上升。见图1。

图1 各组大鼠体质量变化比较

2.2 各组大鼠血清甲状腺激素水平比较 注射131I前，各组大鼠TSH、FT3、FT4水平比较，差异无统计学意义(P>0.05)。注射131I后，药物对照组、131I模型组、ADSCs治疗组大鼠的FT3、FT4水平均低于阴性对照组，TSH水平高于阴性对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)。与131I模型组比较，药物对照组与ADSCs治疗组大鼠的FT3水平均升高，FT4水平均降低，但差异无统计学意义(P>0.05)；药物对照组与ADSCs治疗组大鼠的TSH水平均低于131I模型组，差异均有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 各组大鼠注射131I后血清甲状腺激素水平比较

2.3 各组大鼠炎性因子水平比较131I模型组大鼠的TNF-α、IL-6水平明显高于阴性对照组，1L-10水平明显低于阴性对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)。ADSCs治疗组大鼠的TNF-α、IL-6水平显著低于131I模型组，IL-10水平显著高于131I模型组，但差异无统计学意义(P>0.05)。131I模型组与药物对照组大鼠的TNF-α、IL-6、IL-10水平比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。见图2。

图2 各组大鼠炎性因子水平比较

2.4 甲状腺131I静态显像结果 注射131I前，各组大鼠甲状腺均显影清晰，大鼠轮廓清晰。注射131I后，各组大鼠轮廓清晰，甲状腺区未见明显放射性分布。药物对照组服用左甲状腺素钠后，甲状腺区未见明显核素增浓，但ADSCs治疗组经过干细胞治疗，甲状腺床区可见放射性计数增加，甲状腺较淡显影。见图3。

图3 ADSCs治疗组大鼠甲状腺131I静态显像结果(a.注射131I前，大鼠轮廓清晰，可见消化道显影，甲状腺显影清晰；b.注射131I后，大鼠轮廓清晰，可见消化道显影，甲状腺不显影；c.移植干细胞后，大鼠轮廓清晰，可见消化道显影，甲状腺较淡显影)

3 讨论

甲状腺是人体内最大的内分泌腺体，其功能是合成与分泌甲状腺激素，调节人体正常物质及能量代谢，促进机体生长发育。当甲状腺激素合成和分泌不足时，即发生甲状腺功能减退。有研究表明，甲状腺功能减退可导致心血管功能异常，显著增加心血管疾病的发生率，还可引起血脂代谢紊乱、血压升高，进而导致Ⅱ型糖尿病的发生[3-4]。131I可以在体内参与甲状腺激素的合成和代谢过程，并放射β射线，对甲状腺组织产生电离辐射作用，使滤泡细胞变性坏死，因此，临床上利用131I治疗甲状腺疾病。本研究采用腹腔注射放射性131I的方法建立甲状腺功能减低症大鼠模型，具有操作简便、成功率高、对机体损伤小的优点，可以避免手术造模实验动物存活率低的不足，同时可以减少化学诱导方法对大鼠其他器官的损害。

ADSCs是一类具有自我更新和多向分化潜能的多能干细胞，可以分化形成不同类型的组织器官的细胞，从而修复受损的组织[5-6]。通过体外培养，ADSCs可以被诱导分化成甲状腺细胞，并且具有甲状腺激素分泌功能[7]。本研究结果显示，与131I模型组比较，药物对照组与ADSCs治疗组大鼠的FT3水平均升高，FT4水平均降低，但差异无统计学意义(P>0.05)；药物对照组与ADSCs治疗组大鼠的TSH水平均低于131I模型组，差异均有统计学意义(P<0.05)。这可能是因为血清TSH水平较FT4更敏感，在发生甲状腺功能减退早期，FT4还未检测到异常时，TSH已经发生改变[8]。TNF-α、IL-6、IL-10等是由免疫细胞及组织细胞经刺激而分泌的具有生物学活性的小分子蛋白质，具有调节细胞分化、增殖和诱导细胞发挥各种功能的作用，对于维持机体正常的生理状态和抗御各种损伤具有重要意义[9]。本研究结果发现，131I模型组大鼠的TNF-α、IL-6水平明显高于阴性对照组，1L-10水平明显低于阴性对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)。这提示，131I诱导大鼠发生甲状腺功能减退引起了机体的炎症反应，影响了免疫平衡及稳定。TNF-α、IL-6的过度增殖与免疫细胞介导的炎症反应相关，在甲状腺功能减退发生、发展过程中具有重要作用。TNF-α主要来源于单核巨噬细胞，可以抑制TSH的释放，减少FT3、FT4的释放，调节甲状腺细胞的增殖[10]。IL-6主要来源于成纤维细胞、T淋巴细胞、内皮细胞及单核细胞，具有多种生物活性，在调节免疫应答、造血系统、急性期反应与神经内分泌系统等方面具有重要作用。有研究表明，IL-6浓度在甲状腺功能减退的大鼠中增加[11]。Mikos等[12]报道，甲状腺功能减退患者的TNF-α水平高于空白对照组，TNF-α被认为是甲状腺功能减退的标志物。IL-10主要由Th2细胞产生，可抑制巨噬细胞的活性，从而起到抗自身免疫炎症的作用[13-14]。本研究结果显示，ADSCs治疗组大鼠的TNF-α、IL-6水平显著低于131I模型组，IL-10水平显著高于131I模型组，但差异无统计学意义(P>0.05)。以上结果表明，经过干细胞治疗后，大鼠的炎性因子水平有所改善，但直接补充甲状腺激素仅能调节激素水平，并不能改善大鼠的炎性因子水平。甲状腺131I静态显像结果显示，131I模型组与药物对照组未见甲状腺显影，ADSCs治疗组轻微可见甲状腺显影。这提示，经干细胞治疗后，滤泡细胞功能部分恢复，行使其生理功能，这可能是因为ADSCs移植到大鼠体内促使甲状腺分泌功能增强，或其本身分化生成具有一定生物学功能的甲状腺细胞，但具体原因有待进一步探究。

综上所述，ADSCs移植可能会促进甲状腺激素的分泌，改善甲状腺的摄碘功能，对于放射性131I诱导后大鼠甲状腺功能减退具有一定的潜在治疗作用，其机制可能与促进IL-10的分泌有关。