湘西呆鲤线粒体全基因组测序及结构特征分析

熊 钢，彭英海，向先嘉，周先文,，王 佩，曾 丹，胡亚洲，王晓清

（1.湖南生物机电职业技术学院 生态养殖协同创新中心，湖南 长沙 410127；2.湘西土家族苗族自治州畜牧水产事务中心，湖南 吉首 416000；3.湖南农业大学，湖南 长沙 410128）

湘西呆鲤[1]（Cyprinus carpiovar. Xiangxi）是湖南省湘西山区农民在长期的稻田养鱼模式中选育出的一个地方鲤鱼品种，该鱼具有适应性强、抗病力强、鱼性温顺、逃逸率低等特点。近年来，湘西土家族苗族自治州畜牧水产事务中心与湖南农业大学动物科学技术学院合作开展了湘西呆鲤品种的繁殖、保种和选育推广工作，以提高“湘西呆鲤”良种的生产能力和质量水平[2]，为稻田综合种养技术的发展提供了有力的技术支撑。

线粒体全基因组（mtDNA）具有广泛的种内和种间多态性，为母性遗传，亲缘关系较近的物种之间的进化比核基因进化速度快，是从分子水平研究种群遗传学和进化遗传学的理想对象[3]。而且，脊椎动物线粒体DNA具备结构紧密、无重组、编码效率高、进化速率快和无组织特异性等特点，广泛地应用于系统发育、物种分类和群体遗传进化等领域中[4]。例如：曲宪成等[5]和孙超等[6]以线粒体COI基因为对象分别研究了千岛湖细鳞鲴和光滑河蓝蛤的遗传多样性；颉晓勇等[7]以线粒体Cytb和D-loop基因分析了罗非鱼选育群体遗传结构，胡晓天等[8]则基于线粒体ATP6基因序列研究了30种作物的系统发育。基因测序技术的发展为线粒体全基因组测序提供了更为便捷的方法，例如毛明光等[9]通过二代基因测序技术获得了太平洋鳕（Gadus macrocephalus）线粒体基因组全序列。基于此，研究拟通过第二代测序技术获取湘西呆鲤线粒体全基因组序列，并对该线粒体全基因组序列的结构特征进行分析，为进一步研究湘西呆鲤的遗传进化和分类提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验所用的湘西呆鲤样本取自湖南湘西自治州永顺县小溪乡小溪村。

1.2 线粒体DNA提取

取湘西呆鲤鳍条，采用天泽基因柱式动物DNA提取试剂盒提取湘西呆鲤总DNA。总DNA用1%琼脂糖凝胶电泳检测，-20℃保存备用。

1.3 线粒体基因组测序

DNA样品检测合格后，使用Covaris超声波破碎仪随机打断，再经末端修复、加A尾、加测序接头、纯化、PCR扩增等步骤完成整个文库制备工作，使用Qsep100对文库的插入片段大小进行检测，合格后使用Illumina高通量测序平台（HiSeq X）进行测序。

1.4 基因组组装和注释

利用SPAdes v3.11.1（http://cab.spbu.ru/software/spades/）拼接软件对优化序列进行多个 Kmer参数的拼接，利用MITOS软件对线粒体基因进行预测，分别计算线粒体全基因组、蛋白编码基因、rRNA基因的碱基组成。

1.5 基因二级结构预测

使用在线软件（http://rna.tbi.univie.ac.at ）[10]对线粒体 tRNA的二级结构进行预测。

1.6 系统进化树构建

为了分析湘西呆鲤的系统发育关系, 以目的基因Blast后从GenBank中下载相关基因序列，使用MEGA 6.0软件构建进化树。

2 结果与分析

2.1 湘西呆鲤线粒体基因组结构与特征

研究采用第二代基因测序技术，获得湘西呆鲤线粒体全基因组序列（基因号：MN544290）, 其长度为16 581 bp。全基因组序列包含了13个蛋白编码基因（PCGs）、2个rRNA基因和22个tRNA基因（图1）。H-链编码6个tRNA和ND6基因，L-链则编码其余基因和tRNA，H-链和L-链的编码基因与其他鲤鱼相同。

图1 湘西呆鲤线粒体基因组结构

2.2 核苷酸组成

湘西呆鲤线粒体全基因组中碱基含量由高到低依次为：A(31.88%) ＞ C(27.50%) ＞ T(24.86%) ＞ G(15.77%)，A+T含量达到56.74%，明显高于C+G的含量；以湘西呆鲤线粒体全基因组序列在基因库Blast分析并下载15种鲤鱼线粒体全基因组序列，分析发现15种鲤鱼线粒体基因全长在16 576～16 597 bp范围内；A+T含量在56.65%～57.41%之间，均呈现AT偏向性（表1）；其中A+T含量最多的金鱼（Carassius auratus），A+T含量最少的兴国红鲤 （Cyprinus carpio xingguonensis）。

表1 湘西呆鲤及其他物种线粒体基因组碱基组成比较

2.3 湘西呆鲤线粒体基因注释结果

湘西呆鲤线粒体基因组上的ND6基因在H链上编码蛋白，ND1、ND2、COX1、COX2、ATP8、ATP6、COX3、ND3、ND4L、ND4、ND5和Cytb在L链 上编码蛋白。9个编码基因终止密码子为TAG，4个编码基因终止密码子为TAA（表2）。其中在tRNA-Pro和tRNA-Phe之间存在一个927 bp的D-loop序列片段。

线粒体基因组中的非编码区不参与编码基因，为可调节线粒体DNA复制和转录的片段，主要分布于L-链复制起始区和各个tRNA基因之间。根据非编码区结构组成和分布位置的不同，非编码区可分为基因间隔序列区和基因序列重叠区。在湘西呆鲤线粒体中共寻找到10处重叠区，序列总长度为50 bp；重叠碱基数最长为17 bp，位于tRNA-Glu基因和Cytb基因之间；重叠碱基数最短的为1 bp（表2）。

2.4 tRNA基因二级结构

对湘西呆鲤线粒体22个tRNA基因的定位以及二级结构进行预测分析，结果表明，22个tRNA基因长度为67～76 bp，平均长度为71.09 bp；最短的基因是tRNA-Cys，最长的基因是tRNA-Leu和tRNA-Lys，均为76 bp。tRNA二级结构预测结果显示，tRNAGlu、tRNA-Lys、tRNA-Ser、tRNA-Met、tRNA-Thr、tRNA-Trp和tRNA-His等22个tRNA基因形成的三叶草结构，其中“环”结构长度为7～16 bp，“茎”结构长度为3～7 bp，如图2所示。

图2 部分tRNA二级结构预测图

2.5 同源性分析

对线粒体全长基因组进行同源性分析发现，16种鲤鱼的同源性在89.4%～99.8%之间；兴国红鲤与锦鲤、兴国红鲤与荷包红鲤、荷包红鲤与锦鲤、彩鲤与珠江鲤之间的同源性最大，均为99.8%，湘西呆鲤与Labeo catla的同源性最小，为89.4%（表3）。以D-loop区进行同源性分析，结果如表4所示，湘西呆鲤与15种鲤鱼之间的D-loop区同源性在87.3%～98.8%之间，而线粒体全长基因同源性在89.4%～99.5%之间；大眼鲤与乌原鲤的线粒体全长基因同源性为98.0%，二者的D-loop区同源性为97.9%，除此之外，其他15种鲤鱼之间的线粒体全长基因同源性与D-loop区同源性均相同。

表3 基于线粒体全长基因组同源性 （%）

表4 基于D-loop片段序列同源性 （%）

以线粒体上D-loop序列，采用NJ（Neighborjoining）法构建16种鱼类的系统进化树，如图3所示，彩鲤、乌原鲤、兴国红鲤、荷包红鲤、大眼鲤和金鱼聚成一大簇，建鲤和桂林鲤、尖鳍鲤和瓯江鲤鱼、珠江鲤和三角鲤、锦鲤和三倍体鲤分别成簇，湘西呆鲤和L. catla（分布于印度一种鲤鱼）都单独成枝，湘西呆鲤与L. catla独立于各簇之外，其中湘西呆鲤与锦鲤和三倍体鲤一簇更为邻近。

图3 基于D-loop片段序列构建的NJ进化树

3 结论与讨论

目前，现生鱼类中最大的科是鲤科，大约包括210属2 100种，分布于欧亚大陆、东印度群岛、北美和非洲，在东亚大陆最为丰富，我国有122属600多种[11]。在鱼类分类中，传统的形态学对性状的数据处理分析中，主要利用数理统计分析软件进行形态学数据的聚类分析，随着现代分子生物学技术的发展，分子群体遗传学数据分析方法和处理软件应运而生[12]。例如王成辉等[13]用限制性内切酶对4种红鲤的线粒体DNA（mtDNA）进行限制性片段长度多态性（RFLP）分析，在此基础上推算了各种红鲤的起源和分化时间。

基因进化的速率受选择（selection）和突变（mutation）的影响[14]。鱼类的线粒体基因组同其他脊椎动物一样极为保守[15]。线粒体基因组各区域承担不同的功能，在进化中受到不同强度的选择压力，因而其进化速率和系统发育信息也存在差异[16]。毛明光等[9]以鳕形目下几种鳕为研究对象，以品种间线粒体基因组全序列和Cytb基因构建的进化树就存在一定差异。潘贤辉等[17]分别以线粒体D-loop区和COI基因分析全州禾花鲤（Quanzhou Procypris merus）、融水禾花鲤（Rongshui P. merus）和野生鲤鱼群体的遗传多样性和系统进化关系，结果也存在差异。笔者的研究也发现，以线粒体基因组全序列与D-loop片段序列分析湘西呆鲤与其他15种鲤鱼之间的同源性和进化树，其结果存在一定差异。

线粒体全基因组的进化速度比核基因快[3]，而线粒体全基因组上的D-loop片段序列则比线粒体全基因组进化更快。因此，该研究在分析线粒体全基因组和D-loop片段序列同源性基础上，采用D-loop片段序列构建的系统发育树更能从分子角度呈现出湘西呆鲤的系统进化关系。